《酶免疫分析技术》PPT课件
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《酶免疫分析技术》课件
生物工程
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
酶免疫分析技术在生物工程中广泛应用，如蛋 白质表达、酶催化反应和抗体筛选等。
优点与局限
1 优点
酶免疫分析技术具有高灵敏度、高特异性、 广泛适应性和操作简便等优点。
2 局限
酶免疫分析技术的局限主要包括影响因素较 多、标记物抗原性和稳定性的要求高等限制。
总结
《酶免疫分析技术》是一种重要的生物分析方法，其原理和应用领域广泛。通过本课件的学习，我们对酶免疫 分析技术有了更深入的了解，并了解到其优点和局限。谢谢大家的聆听！
为什么选择酶作为标记物？
酶具有活性强、稳定性好、催化效率高等特点，可以产生放大效应，大幅提高测定的灵敏度。
酶免疫分析技术的发展历程
酶免疫分析技术自20世纪70年代初提出以来，经过不断创新和发展，已成为生物医学和环 境检测领域的重要分析方法。
酶免疫分析技术的原理
酶底物反应原理
酶标记的免疫试剂与待检测物结 合后，通过酶底物的催化反应产 生可检测的信号，如颜色、发光 或电流。
《酶免疫分析技术》PPT 课件
这是一份《酶免疫分析技术》的PPT课件，通过本课件，我们将深入介绍酶 免疫分析技术的原理、主要实现步骤、应用、优点与局限等内容。让我们开 始学习吧！
绪论
什么是酶免疫分析技术？
酶免疫分析技术是一种高灵敏度、高特异性的生物分析方法，通过酶标记的免疫试剂与待检 测物发生特异性反应，再利用酶对底物的催化作用产生信号。
3
信号产生
通过酶底物反应或其他方式，产生与待检测物浓度相关的可检测信号。
酶免疫分析技术的应用
医学诊断
酶免疫分析技术在临床医学中广泛应用，如血 液病、感染性疾病和肿瘤标志物的检测。
环境监测
酶免疫分析技术可用于水质、土壤和空气中有 害物质的监测，对环境污染的快速筛查具有重 要意义。
第九章 酶免疫技术.ppt
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS
2019年10月14
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11
酶和酶作用底物
HRP的常见底物
OPD反应后显橙黄 色，加酸终止反 应后呈棕黄色， 测定波长492nm。 不稳定，致癌性。
TMB反应后显蓝色 ， 加酸终止反应后变 为黄色,测定波长 450nm ，稳定，无 致癌性，ELISA中应 用最广泛的底物。
竞争法
原理：类似检测抗原的竞争法
应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和
乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测
2019年10月14
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43
ELISA检测抗体的方法
捕获法
应用：
病原体急性感染诊断中的IgM型抗体
甲型肝炎HAV-IgM抗体
乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体
2019年10月14
2019年10月14
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33
2019年10月14
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34
E EE
E
E
E
E EE
+
2019年10月14
- 双抗体夹心谢谢法你的测阅读抗原
35
ELISA检测抗原的方法
竞争法
方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗 原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。
应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药
常用酶
RZ值与酶活性无关， 酶活性单位比RZ值 更为重要
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ值：403nm （辅基） 与275nm（主酶） OD值之比
2019年10月14
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《酶免疫分析技术》PPT课件_OK
将已知抗原包被固相载体，待检标本中的相 应抗体可分别与固相表面的抗原、酶标抗原结 合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原复合物，根 据加底物后的显色程度确定待检抗体含量。
2．技术要点 同双抗体夹心法。
40
双抗原夹心法检测抗体
固相抗体
标本（含抗体）
E
底物
E
酶标抗原
E
41
双抗原夹心法测抗体
E EE E EE
55
三、最适工作浓度的选择
（一）间接法检测抗体 1．酶标抗抗体工作浓度的选择 （1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分 别加入已包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度 （A）值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体 的工作浓度。
50
2．技术要点
（1）将抗人IgMμ链抗体包被于固相反应板上， 洗涤。
（2）加人待检标本，温育，洗涤。 （3）加入特异性抗原，温育，洗涤。 （4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。 （5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标
比色仪测定结果。
51
固相捕获法检测lgM抗体
固相抗人lgM抗体
标本（含抗 体）
34
竞争法测抗原
E
E
E
E
（+）
E EE
E EE
（-） 35
（四）间接法检测抗体 1．原理 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相 应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再 用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形 成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗体含量。
第七章酶免疫分析技术第七章酶免疫分析技术第七章酶免疫分析技术第七章酶免疫分析技术酶免疫分析技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定第七章酶免疫分析技术第一节概述一基本原理酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体形成酶标抗体抗原结合物此结合物既保留抗体抗原的免疫活性又保留了酶对底物的催化活性
2．技术要点 同双抗体夹心法。
40
双抗原夹心法检测抗体
固相抗体
标本（含抗体）
E
底物
E
酶标抗原
E
41
双抗原夹心法测抗体
E EE E EE
55
三、最适工作浓度的选择
（一）间接法检测抗体 1．酶标抗抗体工作浓度的选择 （1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。 （2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分 别加入已包被的孔中，温育，洗涤。 （3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度 （A）值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体 的工作浓度。
50
2．技术要点
（1）将抗人IgMμ链抗体包被于固相反应板上， 洗涤。
（2）加人待检标本，温育，洗涤。 （3）加入特异性抗原，温育，洗涤。 （4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。 （5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标
比色仪测定结果。
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固相捕获法检测lgM抗体
固相抗人lgM抗体
标本（含抗 体）
34
竞争法测抗原
E
E
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（+）
E EE
E EE
（-） 35
（四）间接法检测抗体 1．原理 将已知抗原吸附于固相载体上，待检标本中相 应抗体与之结合，形成固相抗原-抗体复合物，再 用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形 成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗体含量。
第七章酶免疫分析技术第七章酶免疫分析技术第七章酶免疫分析技术第七章酶免疫分析技术酶免疫分析技术的分类克隆酶供体免疫测定酶免疫分析技术酶免疫组织化学技术酶免疫测定技术均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶放大免疫测定技术液相酶免疫测定固相酶免疫测定第七章酶免疫分析技术第一节概述一基本原理酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体形成酶标抗体抗原结合物此结合物既保留抗体抗原的免疫活性又保留了酶对底物的催化活性
酶免疫测定技术PPT课件
特异抗原（Ag1）
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 Ag1 Ab1*E
IgM2
编A辑b版1*ppEt
抗人IgMμ链抗体 抗人IgMμ链抗体
IgM1 Ag1
IgM2
16
酶免疫测定技术的应用
均相法 ELISA法
编辑版ppt
17
均相酶免疫测定主要应用于小分子激素和半 抗原（如药物）的测定。
酶免疫增强技术EMIT
编辑版ppt
4
克隆酶供体免疫分析CEDIA
编辑版ppt
5
均相酶免疫测定
测定快速、准确、专一、灵敏
试剂稳定
操作过程简便
数据处理简单
编辑版ppt
6
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
克隆酶供体免疫分析CEDIA 液相酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定 ELISA
编辑版ppt
7
酶免疫增强技术EMIT
编辑版ppt
8
异相酶免疫测定类型
根据检测目的和操作步骤不同： 双抗体夹心法 间接法 竞争法 捕获法
编辑版ppt
9
双抗体夹心法
此法常用于测定抗原，适用于多价大分 子抗原的检测，而不能用于测定半抗原 等小分子物质。
编辑版ppt
10
异相酶免疫测定类型
酶免疫测定技 术
编辑版ppt
1
何为酶免疫测定？
enzyme immunoassay,EIA
抗原抗体反应的特异性
+
酶催化反应的高效性
编辑版ppt
2
酶免疫增强测定技术EMIT
酶免疫测定技术
均相酶免疫测定
酶免疫术课件共19页
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本（Ag）+酶标Ag
★洗涤
★加底物显色
五、膜载体的酶免疫测定
一）斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 二）斑点免疫渗滤试验（IFA） 三）斑点免疫层析试验（ICA） 四）免疫印迹法（IBT）-Western-blot
六、酶免疫组织化学技术
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
19
酶免疫术件
酶免疫技术
一、定义 二、分类
酶免疫组织化学技术
酶免疫测定 均相酶免疫测定
异相酶免疫测定 液相酶免疫测定 固相酶免疫测定
三、常用的酶及底物
常用酶
底物
辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2
（HRP）
四甲基联苯胺、 H2O2
碱性磷酸酶（AP） 对硝基本磷酸脂
显色 橙黄色
蓝色 黄色
四、酶联免疫吸附试验
（enzyme linked immunosorbent assay，ELASA） 一）基本原理
二）技术类型
1、间接法
包被抗原 洗涤 封闭 待测标本 洗涤 加酶标二抗 洗涤 底物显色
2、双抗体夹心法
★包被：
Ab
★洗涤、封闭
★加待测标本：Ag
★洗涤
★加酶标抗体
酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用ppt课件
精选课件
23
• TACTS 洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG ，含0.5%BSA ,TACTS稀释，1:1000，100μL /孔）， 37°C下孵育1h；
• TACTS洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液 (PNPP)1mg/ml，用buffer B溶解，200μL/well），37℃ 下孵育30min；加入50μL 3M NaOH(称0.6g加5ml蒸馏水) 终止反应；5min内405nm波长下检测吸光度。
精选课件
13
精选课件
14
试验原理
• 采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上 预包被抗CHO CHP多抗，免疫反应构成为夹层式 结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清 洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显色 ，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相关 。
精选课件
15
检测步骤：
Plot#4 (150%: Concentration vs MeanValue)
38171.1
B 1.078 1.31 1.54 1.343
1000
10000
C 16.002 15.564 31.632 12.655
D
6571.405
7742.07
79942.739
7056.677
R^2 0.999 0.999 0.999 0.996
； 5、向孔中加入终止液，100 ul/孔，测定OD450nm/570nm
精选课件
7
数据与结果
1. 标准曲线的绘制： （1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分
别计算平均值； （2）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟
相关主题
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③所得酶结合物稳定，本身不发生聚合
④较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的
聚合物
第七章
酶免疫分析技术
1．过碘酸钠氧化法 仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨 基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物
产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结
合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。
第七章
酶免疫分析技术
2．戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与
酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一
步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
第七章
酶免疫分析技术
（二）酶标记物的纯化与鉴定 1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游 离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，
测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
第七章
酶免疫分析技术
（二）碱性磷酸酶
（alkaline phosphatase，AP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物 对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
3
第七章
酶免疫分析技术
第一节
一、基本原理
概述
酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体 (抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既 保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物 的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体)
进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作
用于底物的显色反应来判定结果。
第七章
氧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉
素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。
第七章
酶免疫分析技术
三、酶标抗体(抗原)的制备
制备要求： 抗原要求纯度高、抗原性强。 抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、 易于分离纯化和批量生产。
第七章
酶免疫分析技术
（一）常用的标记方法
标记方法要求：
①方法简单，产率高 ②不影响酶和抗体(抗原)的生物活性
色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定
量。
第七章
酶免疫分析技术
二、酶联免疫吸附试验的类型
（一）双抗体夹心法检测抗原 1.原理 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合
成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成
固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
酶免疫分析技术
二、酶和酶底物
标记酶的要求：
①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
第七章
酶免疫分析技术
（一）辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶
避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)
的竞争作用。 常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
第七章
酶免疫分析技术
2.酶标记物的鉴定 （1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩
散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体 (抗原)具有
免疫活性。 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
第七章
酶免疫分析技术
邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP常用底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
第七章
酶免疫分析技术
OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄 色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。
TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,
第七章
酶免疫分析技术
（三）β-半乳糖苷酶
（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基βD半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
第七章
酶免疫分析技术
（四）其他酶 在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖
E
E
E
第七章
酶免疫分析技术
第七章 酶免疫分析技术第七章酶ຫໍສະໝຸດ 疫分析技术目1 2 3
录
概述 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验的应用和注意事项 其他酶标记免疫测定技术
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4
第七章
酶免疫分析技术
酶免疫分析技术的分类
酶免疫组织化学技术 酶放大免疫测定技术 酶免疫分析技术 酶免疫测定技术 非均相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定
2.糖蛋白（主酶） 主酶与酶活性无关 亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比
4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
第七章
酶免疫分析技术
HRP催化的反应式为：
DH2十H2O2—D十2H20 DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体 HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。
第七章
酶免疫分析技术
双抗体夹心法检测抗原
底物
标本（含抗原）
固相抗体
酶标抗体
E
E
E
第七章
酶免疫分析技术
2．技术要点 （1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。
（3）加酶标抗体，洗涤。
（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。
第七章
酶免疫分析技术
双抗体夹心法测抗原
第七章
酶免疫分析技术
四、固相载体
（一）固相载体的要求 ①结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定；
②可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲
和素等大分子；
③固相化后分子仍应保持活性；
④固相化方法应简便、快速。
第七章
酶免疫分析技术
（二）固相载体的种类 1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状
主要有微量反应板、小试管和小珠三种。
2．微颗粒 或颗粒。 3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球
纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
第七章
酶免疫分析技术
微量反应板
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第七章
酶免疫分析技术
第二节
一、基本原理
酶联免疫吸附试验
将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面， 使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法 将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分 分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显