发酵工程 第三章培养基

原料价格低廉，质量稳定，取材容百度文库；

所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅
拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能 耗。
菌，不像自养菌那样能够利用光、还 原态无机物或碳酸盐作为能源物质， 一. 碳源 只能利用有机碳水化合物作为能源。 用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的来源，并为微生 对于异养微生物，碳源又兼做能源， 物的生长繁殖和代谢活动提供能源。 称为双功能营养物。 主要功能 提供微生物生长繁殖所需的能源； 提供微生物合成菌体的碳成分； 提供合成目的产物的碳成分。 工业生产常用的碳源： 糖类、油脂、有机酸、醇和碳氢化合物等。 如碳源贫乏时，蛋白质水解物或氨基酸等也被作为碳 源使用。

葡萄糖是工业发酵中最常用的单糖，它是由淀 粉加工制备的，有固体粉状和葡萄糖糖浆两种 产品形式。

葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖，所以常作 为培养基的主要成分，并且也作为促进细胞快 速生长的一种有效的糖类物质。
它被广泛用于抗生素、氨基酸、有机酸、多糖、 甾体转化等发酵产品的生产中。

8



但葡萄糖过多会加速菌体的呼吸，在通气不足、 溶解氧不能满足需要的情况下，其代谢中间产物 如丙酮酸、乳酸、乙酸等不完全氧化而积累在菌 体或培养基中，会导致培养基的pH值下降，影响 某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的 合成。 葡萄糖还会引起葡萄糖效应，阻遏微生物利用其 他的糖。 由于葡萄糖等快速利用的糖对产物合成有调节作 用，应控制其浓度，一般是将其和缓慢利用的多 糖组成混合碳源，即有利于菌体生长又有利于产 物形成。
23
3.2 培养基的成分及功能

无机氮源

铵盐((NH4)2SO4 、 (NH4)2Cl、 NH4NO3 )、

硝酸盐(NaNO3、KNO3 )
氨水等。


特点有：① 成分简单，质量稳定； ② 易被菌体吸收利用；

铵盐中的NH4+与细胞中有机氮处于相同的氧化水平(细胞内的含 氮物质也都以氨基或亚氨基的形式存在)，可被菌体直接吸收用于 合成细胞物质；因此NH3· H2O最容易利用，(NH4)2SO4次之。硝酸 盐中的硝态氮需还原成氨后才能被微生物吸收利用，因此铵盐比 硝酸盐能更快被微生物利用。
22
生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。
3.2 培养基的成分及功能

氮源的种类 无机氮源
工业上常用的有机氮源都是 一些廉价的原料或副产品。
有机氮源
氨基氮： NH4OH 合成产物：尿素 (NH4)2SO4 天然原料： 植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、 NH4NO3 棉籽饼粉、菜籽饼粉、 NH4 Cl 麦麸、 玉米浆、玉米麸质粉 硝态氮： NaNO3 动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、 KNO3 蚕蛹粉、牛肉膏 微生物蛋白：酵母粉/浸膏、 废菌丝粉 其它：酒糟等
结果：各种碳源相差不大 推论：该菌种的碱性纤维素酶为组成型
3.2 培养基的成分及功能
二. 氮源


氮源是指构成微生物细胞物质和代谢产物的氮素 的来源。 其主要功能是： 构成微生物细胞结构物质，如氨基酸、蛋白质、 核酸等； 合成含氮代谢产物； 作为酶的组成分或维持酶的活性； 调节渗透压、PH值、氧化还原电位等； 当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。
16




(4) 烃和醇类 近年来随着石油工业的发展，烷烃(一般是从石油裂解 中得到的14～18碳的直链烷烃混合物，以及甲烷、乙 烷、丁烷等)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和 酶制剂的工业发酵中。 甘油、甲醇、乙醇、山梨醇等也用于发酵碳源或生产 某些单细胞蛋白。其他碳源物质如碳酸气、石油、正 构石蜡、天然气等石油化工产品，也是许多微生物的 碳源。 例如，嗜甲烷棒状杆菌可以利用甲醇为碳源生产单细 胞蛋白，对甲醇的转化率可达47％以上。 乳糖发酵短杆菌以乙醇为碳源生产谷氨酸，对乙醇的 转化率为31％，产率达78 g／L。
17


裂烃棒杆菌的青霉素抗性突变株用十六烷作为碳源生产谷 氨酸，在发酵中加入一定浓度的青霉素，谷氨酸产量达84 g／L。用正十四烷生产a-酮戊二酸的产率甚至高于其他碳 源。 某些以乙醇作为碳源的菌体得率比用葡萄糖作为碳源还高。
乙醇 葡萄糖 醋酸 正烷烃(C18) 甲醇 甲烷 含碳量/% 52.2 40 0.50 40 0.43 85 1.40 37.5 0.67 75 0.88 菌体得率/ 0.83 (g细胞/g碳源)
2、有机氮源 来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。 成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。
例如 玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
18
例：地衣芽孢杆菌生产α-淀粉酶
碳源对生长和产酶的影响
碳源 葡萄糖 蔗糖 糊精 淀粉 细胞量 4.2 4.02 3.06 3.09 α-淀粉酶 0 0 38.2 40.2
(半纤维素酶)
(1.5g麸皮)
李江华，无锡轻工大学学报，2004
嗜碱芽胞杆菌(AC-2)中碳源对碱性纤维素酶分泌的影响
苏勤，林业化学与工业，2004
11



工业发酵生产中用的双糖主要有蔗糖、乳糖和 麦芽糖。蔗糖、乳糖可以使用其纯制产品，也 可以使用含有此二糖的糖蜜和乳清，麦芽糖多 用其糖浆。 糖蜜是制糖生产时的结晶后母液，是制糖工业 的副产物，主要含蔗糖(总糖含量可达50％～75 ％)、氮素、无机盐和维生素等营养物质，是微 生物发酵培养基价廉物美的碳源。常用在酵母 和丙酮、丁醇的生产中，在酒精生产中，糖蜜 代替甘薯粉，可以省去糖化工序，简化了生产 工艺。
有机氮源在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基
酸被菌体吸收利用，或进一步分解，最终用于合成菌 体的细胞物质和含氮的目的产物。其主要作用有： ①除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还含有 糖类、脂肪、无机盐、维生素及某些生长因子，因而 微生物在含有机氮的培养基中表现出生长旺盛、菌丝 浓度增加迅速的特点。

在配制培养基时，应该将其他物质的含量充分考虑进去。
30
25

氨水是发酵工业常用的无机氮源，除了作为氮源之外，还可以
调节pH，在许多微生物发酵生产中都有通氨工艺。

例如在青霉素、链霉素、四环类抗生素的发酵生产中采用
通氨工艺后，发酵单位均有不同程度的提高。

在红霉素的发酵生产中通氨工艺不仅可以提高红霉素的产 量，而且可以增加有效组分的比例。

在采用通氨工艺时应注意两个问题：

一是氨水碱性较强，因此在使用时要防止局部过碱，应少
量多次加入，并强强搅拌；

二是氨水中含有多种嗜碱性微生物，因此在使用前要用石 棉等过滤介质进行过滤除菌，防止因通氨而引起的染菌。
26
毛霉产蛋白酶的研究
陈涛，中国酿造，2004
初始pH的影响:
pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大
无机氮源的影响： 硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素
15
(3) 有机酸及其盐类 一些微生物对乳酸、柠檬酸、乙酸、延胡索酸等及其 盐类有很强的氧化能力，因此这些有机酸和它们的盐 也能作为微生物的碳源。 有机酸作为碳源，氧化产生的能量被菌体用于生长繁 殖和代谢产物的合成。 在利用有机酸时，发酵液的pH会随着有机酸氧化而上 升，尤其是有机酸盐氧化时，常伴随着碱性物质的产 生，使pH进一步上升。对整个发酵过程中pH的调节和 控制增加困难。 醋酸盐做为碳源被氧化时，反应如下： CH3COONa + 2O2 2CO2 + H2O + NaOH
3.1 发酵工业培养基的基本要求




必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基 本成分； 有利于减少培养基的单耗，即提高单位营 养物质的转化率； 有利于提高产物的浓度，以提高单位容积 发酵罐的生产能力； 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周 期；

尽量减少副产物的形成，便于产物的分离
纯化，并尽可能减少产生“三废”物质；

糊精、淀粉及其水解液等多糖是仅次于葡萄糖的常用碳源，尤其是 淀粉克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比较低廉。

玉米淀粉及其水解液多用于抗生素、核苷酸、氨基酸、酶制剂等发 酵；小麦淀粉、燕麦淀粉和甘薯淀粉等常在有机酸、醇等发酵中使 用。

另淀粉有直链淀粉和支链淀粉之分，在培养基中用量较大时，发酵 液比较稠，一般>2.0%时要加入一定的α-淀粉酶先行水解。

再它们必须水解成单糖后才能被吸收利用。因此所用微生物必须能 够分泌水解淀粉、糊精的胞外酶。
14
(2) 油和脂肪 在培养基中糖类物质缺乏或微生物生长的某一阶段， 许多微生物可以利用脂类作为碳源和能源生长。许多 霉菌和放线菌都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的 作用下，油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在有氧时， 进一步氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。 可用的油脂类有豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、 棉籽油、玉米油、亚麻子油、橄榄油等。 当微生物利用脂肪作为碳源时，所消耗的氧量增加， 因此要供给比糖代谢更多的氧，不然大量的脂肪酸和 代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下降，并影响 微生物酶系统的作用。 在发酵过程中加入的油脂还兼有消泡的作用。
3 发酵工业培养基设计
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。 发酵培养基的作用：
满足菌体的生长 促进产物的形成
工业微生物发酵培养基的共性



单位培养基能够产生最大量的目的产物； 能够使目的产物的合成速率最大； 能够使副产物合成的量最少； 所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、 易于长期获得； 所采用的培养基尽量不影响工业发酵中通 气搅拌性能以及发酵产物的后期处理。
9
葡萄糖效应

“葡萄糖效应”是研究大肠杆菌利用各种不同混合碳源 的时发现的碳分解产物的阻抑作用。当大肠杆菌培养 于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长 旺盛期。
10
葡萄糖效应

这是大肠杆菌首先利用葡萄糖进行生长繁殖，在 葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖 再生长繁殖。后来的酶学试验证实，当葡萄糖存 在时，细菌不利用其他糖。在上述培养基中即使 加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的 酶系也不能合成。 葡萄糖效应是由葡萄糖的某种分解代谢物引起的， 这种代谢物阻遏了细菌能够利用其他糖的酶的生 成。 后来在许多微生物学的试验中发现，碳分解产物 的阻抑作用普遍存在于微生物的生化代谢中。
工业生产所用微生物绝大多数是异养 3.2 培养基的成分及功能
(1) 糖类：发酵培养基中使用最广泛的碳源。
纯糖 天然原料
碳源物质的易利用顺序： (单)葡萄糖→ (双)蔗糖、麦芽糖、乳糖→ (多)糊精→淀粉
7
单糖：葡萄糖、 木糖 糖 蜜 类：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜 双糖：蔗糖、麦芽糖、 糖 类：麦芽汁 乳糖 淀粉质类：山芋粉、马铃薯粉、 多糖：淀粉、糊精 玉米粉、燕麦粉、 及其水解液 木薯粉 其 它：纤维素水解液、乳清 速效碳源 、 迟效碳源
24





无机氮源被微生物利用后常会引起发酵液pH的变化 铵态氮和硝基氮氮源同化结果： (NH4 )2 SO4→2NH3+H2SO4：NH3被菌体利用，留下H2SO4 则使pH值下降； NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH ：NH3被菌体利用， 留下NaOH使pH值上升； 经过微生物代谢作用后能产生酸性物质的营养成分称为 生理酸性物质；生理酸性物质使pH值下降； 经过微生物代谢作用后能产生碱性物质的营养成分称为 生理碱性物质；生理碱性物质使pH值上升。 正确使用生理酸性物质和生理碱性物质，对稳定和调节 发酵过程的pH有积极作用。

12
糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许 多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。 例：谷氨酸发酵 有害物资：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐