过氧化氢酶(CAT)测定

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实验器材:

紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、天平、100微升枪2支、10ml容量瓶、10 mL试管、具塞试管、5 mL枪一支、研钵

试剂:

(1)0.05mo l·L-1磷酸缓冲液(PH7.0)。

pH 0.05mol/L NaH2PO4(ml) 0.05mol/L Na2HPO4(ml)

5.7 93.5

6.5

5.8 92.0 8.0

5.9 90.0 10.0

6.0 8

7.7 12.3

6.1 85.0 15.0

6.2 81.5 18.5

6.3 7

7.5 22.5

6.4 73.5 26.5

6.5 68.5 31.5

6.6 62.5 3

7.5

6.7 56.5 43.5

6.8 51.0 49.0

6.9 45.0 55.0

7.0 39.0 61.0

7.1 33.0 67.0

7.2 28.0 72.0

7.3 23.0 67.0

7.4 19.0 81.0

7.5 16.0 84.0

7.6 13.0 87.0

7.7 10.5 89.5

7.8 8.5 91.5

7.9 7.0 93.0

8.0 5.3 94.7

(2)200 mmo l·L-1H2O2溶液,30% H2O2 45.44 mL溶于磷酸缓冲液,定容至1 L。

(3)50 mmo l·L-1Tris-HCl缓冲液(PH7.0)(Tris三羟甲基氨基甲烷;氨基丁三醇;缓血酸胺,C4H11NO3):250ml 0.2mol/L的Tris(含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L)+450mL 0.1mol/L的HCl(取83ml浓度为37.2%的盐酸定容至1L),加水稀释至1L。

步骤:

1、酶液提取:取0.5g新鲜植物样品,置于预冷研钵中,加2mL磷酸缓冲液及少量石英砂,

在冰浴上研磨匀浆。

2、将研磨好的匀浆转移至10mL容量瓶中,用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次(每次1-2mL),

转移至容量瓶,定容至10 mL。

3、取提取液5 mL于离心管中,在4℃、15000g下离心15min,上清液即为酶提取液,4℃

下保存备用。

4、取5 mL具塞试管,加2 mL酶提取液于沸水中加热煮死,冷却备用。

6、将试管于25℃水浴中预热3分钟,逐管加入0.2 mL200mmo l·L-1过氧化氢溶液,加完

后立即在紫外分光光度计上测定A240,每隔30S读数一次,共3min,记录测定值。7、计算,CAT活性(U·gFW·min-1)=

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