过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
货号:BC0200规格:50T/48S 产品内容：提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；试剂二：液体100μL×3瓶，4℃保存。
产品说明：CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H 2O 2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
H 2O 2在240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解H 2O 2，使反应溶液240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT 活性。
试验中所需的仪器和试剂：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤：一、粗酶液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（功率20%或200w，超声3秒，间隔10秒。
重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
二、CAT 测定操作1、分光光度计预热30min 以上，调节波长至240nm 处，蒸馏水调零。
2、CAT 检测工作液的配置：用时在每瓶试剂二（100μL）中加入20ml 试剂一，充分混匀，作为工作液；用不完的试剂4℃保存一周。
3、测定前将CAT 检测工作液37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴10min。
4、取1mLCAT 检测工作液于1mL 石英比色皿中，再加入35μL 样本，混匀5s；室温下立即测定240nm 下的初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2。
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
实验九 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
( AS 1 + AS 2 ) 2
作
1.写实验报告 写实验报告 2.问题： 问题： 问题
业：
（1）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些 ）影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些? （2）过氧化氢酶与哪些生化过程有关 ）过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
操作步骤：
3．测定
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的 H2O2 ，每加完一管立即记时，并迅速倒入 石英测2min，记录数据。
4.按下式计算酶活性。
结果计算： 结果计算： 1min内 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 减少0.1的酶量为1个酶活单位（ 0.1的酶量为 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)= 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
A240 = AS0∆A240 × VT
0.1 × V 1 × t × FW
式中： 式中： 加入煮死酶液的对照管吸光值； AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； 加入煮死酶液的对照管吸光值 样品管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； 样品管吸光值 Vt—粗酶提取液总体积 ml）； 粗酶提取液总体积（ Vt 粗酶提取液总体积（ml）； 测定用粗酶液体积（ V1—测定用粗酶液体积（ml）； 测定用粗酶液体积 ml）； FW—样品鲜重 样品鲜重（ FW 样品鲜重（g）； 0.1—A 每下降0.1 个酶活单位（ 0.1为 0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； 加过氧化氢到最后一次读数时间（ t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 加过氧化氢到最后一次读数时间 min）。
操作步骤：
1 ． 称 取 植 物 材 料 0.3g ， 加 入 ， mo1 (pH7 0.1mo1/L 磷 酸 缓 冲 液 (pH7.0) ml(分三次加入 分三次加入， 6ml( 分三次加入 ， 最后两次用于 洗研钵) 在研钵中研磨成匀浆， 洗研钵)，在研钵中研磨成匀浆， 6000r 离心15 分钟， 15分钟 以 6000r ／ min 离心 15 分钟 ， 倾 出上清液。 出上清液。
过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒说明书(钼酸铵法)__ 微量法UPLC-MS-4535
过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒说明书（钼酸铵法）微量法货号：UPLC-MS-4535规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体75mL×1瓶4℃保存试剂一液体15mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×2瓶4℃保存标准品液体0.5mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前取1瓶试剂二加入12.5mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂4℃保存一周。
2、30μmol/mL标准液的配制：标准品置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。
本试剂盒所提供标准品为1mmol/mL H2O2标准溶液，临用前取0.15mL标准品加入4.85mL试剂一稀释或者根据样本量按照比例配制，充分混匀，即为30μmol/mL标准液，现配现用。
产品说明：CAT(EC1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2可与钼酸铵反应形成稳定的黄色复合物，在405nm处有强烈吸收峰，且其吸光值大小与过氧化氢浓度成正比。
通过测定反应体系中剩余的H2O2量，得出被CAT催化分解的H2O2量，进而反映CAT的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、恒温水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌、细胞或组织样本的制备：a、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔9s，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
过氧化氢酶活力的测定实验报告
一、实验目的1. 了解过氧化氢酶的作用和特性。
2. 掌握过氧化氢酶活力的测定原理和方法。
3. 通过实验，验证过氧化氢酶在催化过氧化氢分解过程中的活力。
二、实验原理过氧化氢酶（Catalase，简称CAT）是一种广泛存在于生物体内的酶，其主要功能是催化过氧化氢（H2O2）分解为水（H2O）和氧气（O2），从而降低过氧化氢对生物体的毒害作用。
过氧化氢酶活力的测定通常通过测量在一定时间内过氧化氢的分解量或氧气的生成量来进行。
本实验采用碘量法测定过氧化氢酶活力。
碘量法的基本原理是：在一定条件下，过氧化氢酶将过氧化氢分解，生成氧气，使溶液中的碘离子（I-）氧化成碘单质（I2）。
然后，用硫代硫酸钠滴定溶液中的碘单质，根据消耗的硫代硫酸钠的量计算出过氧化氢的分解量，从而推算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片（如青菜、萝卜叶等）、蒸馏水、碘液、硫代硫酸钠溶液、盐酸、氢氧化钠溶液、0.1 mol/L过氧化氢溶液等。
2. 实验仪器：分析天平、研钵、漏斗、容量瓶、移液管、滴定管、锥形瓶、水浴锅、计时器等。
四、实验步骤1. 酶液提取：- 称取0.5 g新鲜植物叶片，置于研钵中，加入2 mL pH 7.0磷酸缓冲液和少量石英砂，研磨成匀浆。
- 将匀浆转入25 mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容至刻度。
- 将容量瓶置于4℃冰箱中静置10 min，取上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2. 测定过氧化氢酶活力：- 取4个锥形瓶，分别编号为1、2、3、4。
- 向1、2、3号锥形瓶中分别加入0.5 mL过氧化氢酶粗提液，向4号锥形瓶中加入0.5 mL蒸馏水。
- 向各锥形瓶中分别加入1 mL 0.1 mol/L过氧化氢溶液，立即开始计时。
- 当加入0.1 mL 1 mol/L盐酸时，停止计时，此时溶液中剩余的过氧化氢量即为酶促反应所分解的过氧化氢量。
- 向各锥形瓶中加入1 mL碘液，充分振荡，静置3 min。
过氧化物酶活性的测定实验报告
过氧化物酶活性的测定实验报告实验名称：过氧化物酶活性的测定实验实验目的：1. 了解过氧化物酶（CAT）的性质及其在生物体内的作用；2. 学习如何测定CAT活性。
实验原理：CAT是一种重要的氧化酶，在生物体内主要负责清除细胞内的过氧化氢（H2O2）。
CAT能够将H2O2分解为水和氧，从而减少H2O2引起的细胞损伤。
因此，CAT的活性是衡量生物体抵抗氧化损伤能力的重要指标。
该实验通过比色法对CAT活性进行测定，其原理是：CAT能够快速分解H2O2，导致溶液中H2O2浓度的降低，从而使紫外吸收波长为240nm处的吸光度降低。
实验步骤：1.制备1mg/ml的CAT标准溶液；2.制备一定浓度的H2O2溶液；3.将CAT标准溶液和H2O2溶液分别稀释为不同浓度；4.将待测样品（如动物组织、血清等）加入混合液中，使得CAT参与H2O2的分解反应；5.反应10min后，加入硫酸铨（K2Cr2O7）溶液并混匀，其中硫酸铨是一种催化剂，能够加速反应速度；6.反应后，在240nm处测定溶液的吸光度；7.根据不同CAT标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线；8.根据待测样品的吸光度值，利用标准曲线计算出CAT的活性。
实验结果：利用如上实验步骤，我们测得样品A的吸光度为0.56，样品B的吸光度为0.36，样品C的吸光度为0.22。
依据标准曲线的测定结果，我们可分别计算出样品A、B、C的CAT活性分别为12.3、8.4、5.2 U/g。
实验结论：本实验采用比色法测定了不同样品中CAT的活性。
结果表明，样品A的CAT活性最高，样品C的CAT活性最低。
通过该实验，我们可以了解CAT的性质及其在生物体内的作用，同时也掌握CAT活性的测定方法。
过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒说明书
过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒说明书微量法货号：BC0205规格：100T/96S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系吉至工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体110mL×1瓶4℃保存试剂一液体30mL×1瓶4℃保存试剂二液体110μL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂二：液体置于试剂瓶内EP管中，使用前需先离心。
2、检测工作液的配制：A、使用96孔UV板，取试剂二25μL中加入5mL试剂一，充分混匀，作为工作液（约26T），现用现配；也可根据样本量按比例配制（提供一个15mL空瓶）。
B、使用微量石英比色皿，取试剂二25μL中加入6.5mL试剂一，充分混匀，作为工作液（约34T），现用现配；也可根据样本量按比例配制（提供一个15mL空瓶）。
产品说明：CAT(EC1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。
H2O2在240nm下有特征吸收峰，CAT能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔（UV板）、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌、细胞或组织样本的制备：a、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
b、组织：按照组织质量（g）：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。
过氧化氢酶(CAT)酶活测定方法
过氧化氢酶酶活测定方法
一配溶液:
1. 1.5% NaBO3·4H2：
称取1.5g NaBO3·4H2O溶于100ml纯水
2. 0.067M 磷酸盐缓冲：
称取磷酸氢二钠 2.398g溶于100ml纯水，另称取磷酸二氢钠 1.05g 溶于100ml 纯水中，按配方配置成PH为6.8的PBS
3. 1M硫：
10.87ml浓硫酸加入200ml纯水中
4. 0.05M高锰：
0.79g高锰酸钾溶于100ml纯水中。
5. HCl溶液：调PH
二仪器：37°水浴箱，，滴定管，PH试纸，移液器，15ML的离心管，烧杯三步骤：
1.预先用HCL将pH调至6.8的1.5%NaBO3·4H2O 8mL加入含有1.5mL
0.067M ph6.8的磷酸盐缓冲液的烧杯中。
2.在37℃下保持20min后，实验组加入0.5ml酶，对照组加入等量的缓冲
液，混合摇匀。
3．5分钟后，加入到10ml1M硫酸中
4. 在烧瓶中用0.05M高锰酸钾滴定。
5. 结果表示为硼酸单位/每克酶
四计算公式：
酶活力=(V blank—V sample)×0.05×稀释倍数/(样品浓度×0.5) ×(1000/5min)×1000(U/g)
1。
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法
果蔬CAT过氧化氢酶测定方法过氧化氢酶是一种存在于许多生物体中的酶，能够将过氧化氢转化为水和氧气。
它在果蔬中的测定方法主要是通过检测其催化过氧化氢分解反应的速率来确定其活性水平。
下面将详细介绍果蔬CAT过氧化氢酶测定方法。
CAT活性的测定方法有许多种，比较常用的方法主要包括荧光法、吸收光谱法和高效液相色谱法。
这里将重点介绍吸收光谱法和高效液相色谱法。
吸收光谱法是通过测定CAT在特定波长的吸光度变化来计算其活性。
具体步骤如下：1.制备样品：将需要测定CAT活性的果蔬样品如苹果、西红柿等取样，剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.准备试剂：制备过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液，分别用于添加到样品中。
5.反应：将等量的样品、过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液混合，开始反应。
在特定波长下，间隔一段时间后，测量吸光度的变化。
6.计算活性：通过吸光度的变化计算出CAT的活性值，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
高效液相色谱法也被广泛应用于CAT活性的测定。
具体步骤如下：1.制备样品：同样，将需要测定CAT活性的果蔬样品剥去外皮并搅碎成泥状。
加入适量的缓冲液，使得样品浓度适当。
2.破碎细胞：将样品放入破碎细胞器中，用超声波或搅拌器将样品破碎，使细胞内的酶释放出来。
3.离心：将破碎后的样品进行离心，除去细胞碎片和其他杂质。
4.蛋白质沉淀：将样品中的蛋白质沉淀出来，去除其他有干扰的物质。
5.准备色谱柱：将样品中的蛋白质溶液加入高效液相色谱仪的色谱柱中。
6.诱导反应：添加过氧化氢溶液和过氧化氢酶溶液到色谱柱中，开始诱导CAT的催化反应。
7.分离与检测：在高效液相色谱仪中，通过色谱柱对样品中的CAT和其他物质进行分离，并实时监测其峰值的变化。
8.计算活性：通过峰面积的计算，可以计算出CAT的活性，单位为单位时间内分解过氧化氢的酶活性。
CAT过氧化氢酶活性测定方法
CAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶（catalase，CAT）是一种常见的酶，广泛存在于细胞质和线粒体中，能够催化过氧化氢分解为氧气和水。
CAT活性的测定是评价细胞氧化应激和抗氧化能力的重要方法之一、本文将介绍两种常用的CAT活性测定方法：碘化钾法和比色法。
1.碘化钾法：碘化钾法是利用过氧化氢在碱性条件下与碘离子反应生成氧气，然后通过滴定测定碘化钾的消耗量，间接测定CAT活性。
实验步骤如下：1）制备适量的超纯水溶解适量的碘化钾，并与浓度为0.1M的Na2CO3缓冲溶液混合，调整pH至10-112）将待测样品加入上述溶液中，使得总体积约为2mL。
3）在和样品相同条件下作空白对照实验。
4）加入10%的H2O2溶液激活酶，使得最后的浓度约为0.1%。
5）停止反应，一般方法是加入0.1M的硫酸停止酶促反应，使得酶催化生成的氧气转化为水。
6）滴定反应液中的I2溶液，直至反应液呈深蓝色为止。
7）计算CAT活性，根据滴定的I2溶液量计算反应液中过氧化氢含量，再用过氧化氢摩尔浓度除以单位时间，得到CAT的活性。
2.比色法：比色法是通过测量酶催化H2O2分解时产生的物质的吸光度或荧光强度变化来间接测定CAT活性。
实验步骤如下：1）将待测样品加入适量的酶活化缓冲液中。
2）加入适量的过氧化氢（一般浓度为10mM）。
3）在和样品相同条件下作空白对照实验。
4）置于适当的反应温度下孵育一段时间。
5）停止反应，一般方法是加入NaOH溶液，将反应液pH调至碱性，停止酶促反应。
6）测定反应液中的吸光度或荧光强度。
7）根据标准曲线计算CAT活性，通过反应液的吸光度/荧光强度与CAT活性的关系曲线，计算待测样品中CAT的活性。
总结：CAT活性的测定方法主要有碘化钾法和比色法，两种方法均是通过间接测定过氧化氢酶催化反应产物氧气的生成量来计算CAT活性。
碘化钾法利用滴定I2溶液的消耗量计算CAT活性，而比色法则通过测定酶催化反应产物的吸光度或荧光强度来计算CAT活性。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。
其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。
测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。
1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。
常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。
羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。
2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。
3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。
常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。
酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。
常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。
离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。
上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。
蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。
CAT的活性测定-紫外吸收法
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法一、仪器与用具紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶1个；刻度吸管2支，2ml 刻度吸管1支；10ml 试管3支；恒温水浴；二、试剂L 磷酸缓冲液L H 2O 2（用L 高锰酸钾标定）。
[L H 2O 2：市售30%H 2O 2大约等于L ，取30%H 2O 2溶液，稀释至1000ml ，用标准L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；L 高锰酸钾标准液称：取KMnO 4（AR ），用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，再用L 草酸溶液标定；L 草酸：称取优级纯 ，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。
]三、步骤1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml 离心管中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液。
置5℃冰箱中静置10min ，在4000rpm 下离心15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.测定：取10ml 试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H 2O 2样品液配置表25℃预热后,逐管加入 L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
四、结果计算：以1min 内A 240减少的酶量为1个酶活单位（u ）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FW t V .V A T⨯⨯⨯⨯124010∆式中∆A240 = A S0－() A AS S122+A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；—A240每下降为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
过氧化氢酶活性的测定
A 空 10 5 白
B 反 10 应
55 - 1
分 钟
5
51
医学课件ppt
3
5 VA(空白)
=
VB(反应
35
液)
=
8
五、实验结果与计算：
1、被分解的H2O2量（mg） = （空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17
2、CAT活性（mg.g-1.min-1）= 被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量) 样品重（g）×时间（min）
H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O
I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）
用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应
液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分
解的H2O2量。
医学课件ppt
5
三、实验材料、仪器和试剂：
医学课件ppt
6
四、实验步骤：
1、酶液提取：
称取0.5g三叶草，加少量石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆， 移入50ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。
2、酶促反应：
（1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶 中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。
医学课件ppt
9
六、思考题：
1、本实验中影响CAT活性测定的因素有哪些？
医学课件ppt
10
记录两次消耗Na2S2O3的体积医VA学(课空件白p)p，t VB(反应液)。
7
酶活性测定
管 号
酶 液
实验九_过氧化氢酶(CAT)活性的测定
实验九_过氧化氢酶(CAT)活性的测定一、实验目的1.了解过氧化氢酶的作用和测定方法。
二、实验原理过氧化氢酶(CAT)是一种广泛存在于生物体内的酶，其主要作用是催化过氧化氢(H2O2)分解为水(H2O)和氧(O2)，具有清除细胞内产生的过氧化氢的作用，从而保护细胞免受氧自由基的损伤。
测定过氧化氢酶活性的基本原理是利用过氧化氢酶催化过氧化氢分解的特性，测定其对过氧化氢的催化效率，从而求得过氧化氢酶的活性。
三、实验步骤1.将0.05 mL的0.1 mol/L H2O2加入到0.95 mL反应液中，混匀。
2.分别分装0.1 mL过氧化氢酶标准液A(1 U/mL)、待测样品液和纯水于三个小瓶中。
3.向3个小瓶中加入0.6 mL反应液，混匀后立即读取吸光度值。
4.将三个小瓶依次放入比色皿中，加入等体积的反应液，混匀。
5.在室温下，按照每分钟一次，共计计时5分钟，依次读取吸光度值。
6.根据吸光度值计算过氧化氢酶的活性。
四、实验注意事项1.使用新鲜的过氧化氢酶，避免长时间贮存或受热的过氧化氢酶，因其活性会降低。
2.必须按照比色皿上的顺序加入待测样品、过氧化氢酶标准液和纯水。
3.测定过氧化氢酶活性时，要注意比色皿内的反应物混匀程度和加液顺序。
4.读取吸光度时，要记录时间，使时间相同，以便计算活性值。
五、实验结果处理1.计算反应液的吸光度(OD)值。
2.计算酶活性的计算式为：CAT活性=(sample-Blank)/F/(T2-T1)其中，sample为待测样品的吸光度值；Blank为加入纯水的比色皿的吸光度值；F为稀释系数；T2-T1为反应时间，单位为分钟。
1.活性计算结果应该合理，符合实验要求。
2.实验结果能够表明过氧化氢酶的活性。
七、实验总结本次实验通过测定过氧化氢酶活性的方法，了解了测定过氧化氢酶活性的原理，熟悉了测定过氧化氢酶活性的步骤和操作方法。
同时，也掌握了计算过氧化氢酶活性的方法以及如何进行实验结果分析。
过氧化氢酶活性的测定
=
VB(反应
35
液)
=
五、实验结果பைடு நூலகம்计算：
1、被分解的H2O2量（mg） = （空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17
2、CAT活性（mg.g-1.min-1）= 被分解的H2O2量（mg）×(总体积÷测定取液量) 样品重（g）×时间（min）
六、思考题：
1、本实验中影响CAT活性测定的因素有哪些？
（6）20% KI
四、实验步骤：
1、酶液提取：
称取0.5g三叶草，加少量石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆， 移入50ml容量瓶，冲洗研钵数次，定容，静置，过滤。
2、酶促反应：
（1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶 中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。
H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以 钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代 硫酸钠滴定碘，反应式为：
H2O2（余）+2KI+H2SO4----→I2+K2SO4+2H2O I2 +2Na2S2O3 --→2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠） 用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应 液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分 解的H2O2量。
酶活性测定
管 号
酶 液
(ml)
1.8M H2SO4 (ml)
0.05M
H2O2
保 温
1.8M 20% 钼酸 淀粉 H2SO4 KI溶 铵溶 溶液 (ml) 液(ml) 液(滴) (滴)
0.2M
Na2S2O3 溶液的 滴定量
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法
抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。
因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。
直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。
下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。
1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。
（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。
实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。
b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。
c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。
d.使上述反应在37℃下进行10分钟。
e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。
f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。
（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。
实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。
b.分别加入适量的SOD样品。
c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。
d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。
2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。
（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。
实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。
过氧化氢酶活性
过氧化氢酶活性过氧化氢酶（Catalase, CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化植物体内积累的过氧化氢（H2O2）分解为水和分子氧，从而减少H2O2对果蔬组织可能造成的氧化伤害。
在CAT催化H2O2分解为水和分子氧的过程中，该酶起电子传递作用，而过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。
酶2H2O2 →2H2O + O2因此，可根据反应过程中过氧化氢的消耗量来测定该酶的活性。
过氧化氢在波长240 nm处除具有吸收峰，利用紫外分光光度计可以检测过氧化氢含量的变化。
三、材料、仪器及试剂（一）材料苹果、梨、番茄等。
（二）仪器及用具研钵、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、计时器、移液器、离心管、容量瓶（100 mL、1 000 mL）。
（三）试剂1．100 mmol/L、pH 7.5磷酸缓冲液母液A（200 mmol/L Na2HPO4溶液）：称取35.61 gNa2HPO4·2H2O或53.65 g Na2HPO4·7H2O或71.64 gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L NaH2PO4溶液）：称取27.6 gNaH2PO4·H2O或31.2 g NaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。
取84.0 mL母液A和16.0 mL母液B混合后，调节pH至7.5，然后稀释至200 mL。
2．提取缓冲液（含5 mmol/L DTT和5% PVP）称取77 mg DTT，5 g PVP，用100 mmol/L、pH 7.5磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL，即得提取缓冲液，低温（4℃）贮藏备用。
2．20 mmol/L H2O2吸取227 µL的30% H2O2，用50 mmol/L、pH 7.5的磷酸缓冲液稀释至100 mL，现用现配，低温避光保存。
四、实验步骤（一）酶液制备称取5.0 g果蔬样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液，低温保存备用。
过氧化氢酶活力测定CAT
过氧化氢酶活力测定CAT过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。
学习几种测定 CAT活性的方法，理解其测定原理。
一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。
H0的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。
其原22理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。
根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。
其反应为:HO十2KI十HS0 ?I十KS0十2H0 22242242I+2NaSO?2NaI+NaS0 222346二、材料、设备与试剂1(植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。
2(主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml三角瓶。
3(试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。
(3)10,的钼酸铵溶液:称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。
(4)1,淀粉溶液:取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl防腐)。
2(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取NaSO?5HO 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，2232加入约0.1gNaCO，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。
一天后进行标定。
23标定方法:精确称取分析纯KCr0约0(15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解， 227加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr离子的颜色)为止。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
过氧化氢酶(CAT)活性测定
高锰酸钾滴定法
(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理
过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22
R(Fe OH
3+－) R(Fe2+
2 2)
2
+2 H O
2＋O2
因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
植物器官(花瓣、叶片等)
(二)仪器设备
冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管
(三)试剂
(1)10% H2SO4
(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液
(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制
成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定
(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用
0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定
(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤
(一)酶液提取
取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
(二)取50mL三角瓶4个(两个测定，另两个为对照)，测定瓶加入酶液2.5mL，对照加
煮死酶液 2.5mL，再加 2.5mL0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO42.5mL。
(三)用0.1mol/L高锰酸钾标准液滴定，直至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。
四、结果计算
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：
过氧化氢酶活性=[(A-B)×(V T/V S)×1.7]/(W×t) [mg/(g.min)]
式中：A为对照KMnO4滴定毫克数；B为酶反应后KMnO4滴定毫克数V T为提取酶液总量，mL；Vs为反应时所用酶液量，mL；W为样品鲜重，g；t为反应时间，min；1.7为1mL 0.1mol/L高锰酸钾，相当于1.7mg H2O2。
五、注意事项
所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。