液相色谱解析

(3) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效，现在已经有超 高速高效液相色谱。
(4) 液相色谱检测器
按检测对象分类
溶质型检测器：对组分的物理或物理化学特性有响 应：紫外、荧光、电化学
总体检测器：对试样或洗脱液总的物理或物理化学 特性有响应：示差折光、介电常数、激光散射检测器
液固吸附色谱法
固定相为固体
• 硅胶silica 和 alumina（氧化铝） 是最常用的固定相
通过一系列的吸附/脱附步骤形成分离 • 样品分子对固定相的吸附程度不同而形成分离
流动相
固定相
液液分配色谱法
iorg Ki iaq 流动相 固定相 涂布式固定相缺点：固定液易流失，重现性差，且不适合 梯度洗脱和采用高速流动相 固定液易流失 化学键合固定相
1、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱GC的比较
HPLC 1、几乎可以分析各种化合物
2、可用于热不稳定物质的分析
3、柱效不会很高 4、流动相有毒，费用较高 5、仪器制造难度较大
GC 只能分析挥发性物质，约20%的化合物 不能用于热不稳定物质的分析
可得到很高的柱效 流动相为气体，无毒、易处理 仪器制造难度较小
e.电化学检测器
特点：1. 灵敏度高，可测至10-15 mol·L-1；
2. 选择性好，只响应电活性物质； 3.线性范围宽，可达45个数量级。
HPLC-ECD法是目前多组分复杂样品分析中的一个重 要手段,尤其在分析低浓度生物样品中具有不可替代的 优势，逐渐受到生命科学和分析科学工作者的关注
f.质谱仪
光电二极管阵列检测器
c. 示差折光检测器
除紫外检测器之外应用最多的检测器； 连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光 指数差值。差值与浓度呈正比； 通用型检测器(每种物质具有不同的折光指数)； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；
d. 荧光检测器
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、氨基酸、甾类化合物 等有响应；
分离条件的选择：样品、固定相、流动相、洗脱方式
一、分离类型选择
二、流动相的选择
1. 流动相的基本要求
（1）与色谱柱不发生不可逆化学变化，即保留柱效或柱 子的保留性质长期不变；
（2）能溶解被分离的样品； （3）与所用的检测器匹配； （4）黏度尽可能小，以获得高的柱效； （5）价格便宜、毒性小、易于纯化；
化学键合相具有以下特点：
1）固定相不易流失，柱的稳定性和寿命较高。 2）能耐受各种溶剂，可用于梯度洗脱。 3）表面较为均一，没有液坑，传质快，柱效高。 4）能键合不同基团以改变其选择性，例如键合氰基、氨基等
极性基团用于正相色谱法，链合离子交换基团用于离子色 谱法，键合C2， C4， C6， C8， C16， C18， C22烷基和苯基等 非极性基团用于反相色谱法等。因此，它是HPLC较为理 想的固定相。
2. 流动相选择的基本原则
原则： 与固定相极性越接近的流动相，其洗脱能力越
强。
例：采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。
也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。
常用溶剂的极性顺序：
水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳> 环己烷>己烷>煤油(最小)
a. 紫外检测器
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 1、灵敏度高；
2、线形范围高； 3、流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）； 4、对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱； 5、波长可选，易于操作；
b. 光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法，简称键合相 色谱。用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的 硅醇基（Si-OH)与有机分子成键，利用化学反应将有机分子键合到载 体表面上，形成均一的、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相 。采用的键合反应有酯化键合(Si—O—R型)、硅烷化键合(Si-O-Si-R型 )和硅氮键合(Si-N型)等。以硅烷化键合反应最为常用.
特点：1. 灵敏度高，可获得待测化合物的结构信息
(5)附属部件
脱气装置，自动进样装置，梯度洗脱装 置，柱温箱，衍生系统，馏分收集装置以及 数据处理等装置
如使用得当，会大大提高仪器的功能和提高 工作效率
§3.3 高效液相色谱分类及原理
高效液相色谱法的类型按组分在两相间分离机理的不同 主要分为：液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与 反相）、离子交换色谱法及分子排阻色谱法。 其中：以反相的化学键合相色谱应用最为广泛
§3.2 仪器结构
1.结构流程
储液器
高压泵
梯度洗 脱装置
进样器
色
谱
记录仪
柱
馏分 收集器
检测器
2.主要部件
(1) 高压输液泵 要求：
能在高压下连续工作 (>5000psi) 较宽的可程序控制的流速范围 耐化学腐蚀 无脉动输出 输出流量稳定、重复性好 易安装维护
(2) 进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
第三章 高效液相色谱法
§3.1 概述 §3.2 仪器结构及分离原理 §3.3 高效液相色谱分类及原理 §3.4 色谱分离条件的选择与优化 §3.5 高效液相色谱方法的建立和应用
§3.1 概述
流动相是液体的色谱法称为液相色谱法。液相色谱可分为平板色谱和 柱色谱，在液相柱色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵 输送流动相，全部工作通过仪器来完成,这种色谱法称为高效液相色谱法.
离子交换色谱法
固定相表面带与被分析物相反电荷
• 一般使用弱离子交换树脂
根据电荷相互作用力的强弱产生分离
流动相
固定相Βιβλιοθήκη Baidu
分子排阻色谱法
依照分子大小分离 • 固定相材质具有不同大小孔径 • 大分子因其经过的路径短，所以先流出 • 主要应用于聚合物、蛋白质等分子量范围的测定
§3.4 色谱分离条件的选择与优化