分子荧光光谱法
分子荧光分析法实验讲义
5.空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样
架内，在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计 算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近 零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
6.系列维生素Ｂ２标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测
3.仪器自检： 预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”
图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此 时仪器操作软件打开。
若此时软件为“光谱测定”模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软 件转为“定量测定”界面模式。
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度计与紫外-可见分光光度计在光路设置
上有什么不同？为什么？
1.5 分子荧光分析法的应用简介
★ 常规分析应用：
☆ 定性分析：φf；λex；λem；峰形等 ☆ 定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C ☆ 其它（略）
2.2 实验流程
1、VB2的荧光光谱的绘制 2、标准工作曲线的制作 3、未知液的测定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开
关，开启电脑。预热仪器20分钟。
2. 配制系列维生素Ｂ２标准溶液： 取5个干净的50ml容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0,
4.0 , 5.0ml浓度为10.0μg/ml的维生素Ｂ２标准溶液用水稀释 至刻度，摇匀。
10-6 ~ 10-2 s F 荧光： 10-9 ~ 10-6 s
分子荧光光谱法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
荧光分析法的应用
无机物分析 无机离子中除少数例外一般不发荧光.但很多 无机离子能怀一些有机试剂形成荧光络合物,而进行定量 测定.
生物化学及生理医学方面的应用 荧光法对于生物中许多 重要的化合物具有很多的灵敏度和较好的物效性,故广用 于生物化学分析,生理医学和临床分析.
药物分析
目前还采用荧光分光光度计作为高效液相色谱,薄层色谱 和高效毛细管电泳等的检测器,使有效的分离手段与高灵 敏度,高选择性的测定方法结合起来,可用于测定复杂的混 合物.
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大； ★PH 带有酸性或碱性取代基的芳 香化合物的荧光与pH有关； ★溶剂 溶剂极性增加有时 会使荧光强度增加，荧光波长红移； 若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧 光物质电离状态改变，会使荧光强度 、荧光波长改变；含重原子的溶剂 （碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 ★溶解氧的存在往往使荧光强度 降低。 ★激发光的照射
第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法分子荧光光谱法是一种非常有用的分析技术，它可用于测定溶液中分子结构、组成、组分和吸收特性，以及提供关于反应机理的许多信息。
它被广泛应用于化学研究、生物研究、环境研究和制药技术等多个领域。
荧光光谱反应的本质是，一些物质能够从激发态吸收来自外部光源的一定能量，并从激发态到低能量的稳定态跃迁，从而释放出某种光，而这些释放出来的光就是荧光光谱。
基本原理在分子荧光光谱中，激发态是将能量投射到分子上，使其进入一种不稳定的、能量较高的激发态，然后分子会自动以一定的速率从这种高能态向低能态跃迁，跃迁过程中会释放出一定能量的荧光光谱。
具体而言，当激发态的分子能量超过一定的最低能量时，它将进入具有较低能量的稳定态，从而释放出光子。
通常说，这些释放出的光子的频率与激发态的能量有关。
应用分子荧光光谱法可以用于识别、测定和分离不同物质，它可以用于研究有机物、无机物、金属离子和药物，也可用于检测有毒物质。
分子荧光光谱法还可以用于研究分子间相互作用、分子构型变化和反应机理等问题，可以用来研究复杂有机化合物中的加合反应，也可以用来研究金属离子与有机物之间的相互作用。
优缺点分子荧光光谱法具有灵敏度高、分析结果准确、操作简单、检测范围广等优点，可用于大量的物质的有效分析。
此外，它还具有自动控制设备、能测出大量小浓度物质等优点。
然而，分子荧光光谱法也有一些缺点，比如它只能测量没有涂料、沉淀物和色素的物质，而且只有在激发态跃迁释放出荧光时，它才能完成光谱测量。
结论分子荧光光谱法是一种广泛应用的分析技术，它具有敏锐的测量特性，可以快速、准确地测量多种物质，因此被广泛应用于诸多研究领域。
不仅如此，它的测量过程还简单易行，使它可以成为一个非常有用的分析工具。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分子荧光光谱分析
分子荧光光谱分析分子荧光光谱分析的原理是基于分子的激发态能级和基态能级之间的电子跃迁。
当分子受到外界的激发能量（如光能）时，部分分子中的电子从基态跃迁到激发态。
当电子从激发态返回基态时，会释放出荧光光子，其能量与激发态的能级差相关。
这种发光现象被称为荧光。
荧光光谱是通过测量荧光发射的强度和波长来获得的。
通常情况下，荧光光谱的波长范围较宽，可以从紫外到可见光甚至红外。
荧光峰的位置和强度可以提供分子的结构信息，如它们的共振结构、官能团的位置和取代基的影响等。
因此，荧光光谱分析被广泛应用于有机分析化学、生物化学、医药化学等领域。
在分子荧光光谱分析中，常用的实验方法包括荧光激发光谱、荧光发射光谱和荧光寿命测量。
荧光激发光谱是测量分子在不同激发波长下产生的荧光发射强度的方法。
通过测量不同波长的激发光强度和相应的荧光发射强度，可以绘制激发光谱图。
从激发光谱图中，可以确定最佳的激发波长和激发强度，以获得最大的荧光发射信号。
荧光发射光谱是测量荧光信号的强度和波长的方法。
在荧光发射光谱实验中，分子在固定的激发波长下，通过改变检测器的波长来测量荧光光谱。
从荧光发射光谱图中，可以观察到不同波长下的荧光发射峰，并判断荧光光谱的特征。
荧光寿命测量是测量分子从激发态退激发到基态的时间的方法。
荧光寿命是荧光信号从达到最大强度到减少到原始强度的时间。
荧光寿命的测量可以提供有关分子动力学和化学反应速率的信息。
分子荧光光谱分析在许多领域有着广泛的应用。
例如，在环境监测中，可以通过测量水中有机物的荧光光谱来检测水中有机污染物的存在和浓度。
在生物药物研究中，荧光标记的分子可以用于检测和定量分析生物标志物的表达和鉴定。
此外，荧光光谱分析还可以用于材料科学、食品分析等许多其他领域。
总之，分子荧光光谱分析是一种重要且常用的分析方法，通过测量荧光发射的强度和波长可以获得分子的结构和性质信息。
不同的实验方法可以用于研究不同的分子特性和反应过程。
分子荧光光谱法剖析
达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的
最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出
的光线称为磷光。
由于激发三重态能量较激发单重态低，所以
磷光的波长比荧光的波长稍长。
磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测
到。因此磷光很少应用于分析。
内转换
振动弛豫 内转换 系间跨越
S2 T2
S1
能 量
T1
发
发
射
7
275~345
5
290~380
0
平面刚性构造效应
可降低分子振动，削减与溶剂的相互
作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相像
构造，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。
〔2〕 荧光量子产率Φ
物质分子放射荧光的力量用荧光量子产率〔Φ〕 表示：
发射荧光的分 发子 射数 的光子数 Φ= 激发态的分=吸 子收 数的光子数
单重态： 一个分子中全部电子自旋都配对的电 子状态。
三重态： 有两个电子的自旋不配对而平行的状 态。激发三重态能量较激发单重态低。
大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且 自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所 以大多数分子在基态时处于单重态。
当分子受光照射时，假设光子能量恰好等于分子的 某两个能级的能量之差，则分子吸取光子并从基态 跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能 级。但其自旋方向不会马上转变，分子仍处于单重 态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转， 生成三重态。
分子荧光光谱法
Molecular Fluorescence Spectroscopy
荧光是指一种光致发光 的冷发光现象。当某种 常温物质经某种波长的 入射光〔通常是紫外线〕 照射，吸取光能后进入 激发态，并且马上退激 发并发出比入射光的的 波长长的出射光〔通常
分子荧光光谱法原理和仪器
分子荧光光谱法是一种分析化学方法，通过观察和测量分子在激发光作用下 发出的荧光来研究分子结构和性质。
了解分子荧光光谱法的原理和仪器有助于我们更好地理解其应用领域和实验 操作。
荧光分子和激发过程
荧光分子是能够吸能量并将其转化为发射荧光的分子。激发过程包括吸收光、激发态、发光和退激态。
通过深入了解荧光光谱法的原理和仪器，我们可以更好地理解其在实验中的 应用和限制。
吸收光
荧光分子通过吸收光子的能量，使得电子从基 态跃迁到高能级的激发态。
激发态
激发态是荧光分子处于高能级的状态，此时分 子能够进行振动或旋转。
发光
当激发态的荧光分子退回到基态时，它们会通 过发射光子的方式释放掉多余的能量。
退激态
退激态是荧光分子回到基态的过程，荧光的强 度和寿命取决于其退激速率。
荧光光谱仪的主要结构
荧光光谱仪由光源系统、内部光路、检测系统和计算机控制组成。
光源系统
提供激发光源，常见的光源包括氙灯、氙气甚至激 光。
内部光路
引导激发光、荧光光和散射光以及其他传感器的光 线。
检测系统
用于测量发出的荧光光的光子数量，并将其转化为
计算机控制
用于采集和处理光谱数据，并进行分析和解释。
荧光光谱法的应用领域
材料科学
用于研究材料的荧光性质，如半导体材料的能 带结构。
环境监测
检测水质、大气污染物和土壤污染物。
生物医学
用于分析生物分子、蛋白质和细胞的结构、功 能和相互作用。
食品安全
用于检测食品中的污染物、添加剂和营养成分。
总结与展望
分子荧光光谱法是一种强大的研究工具，能够提供丰富的信息和数据。随着 技术的发展，我们可以期待其在更广泛的领域得到应用。
分子荧光光谱法
（1）荧光与结构的关系
电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至三重态的 的速率常数较小，有利于荧光的产生。 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物的荧光最 常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的 脂肪族化合物也可能产生荧光 取代基效应： 苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而 给电子基会使荧光增强。
（2）环境因素 ①温度 温度对荧光的影响很大。 温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率， 因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶 液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%， 当温度降低至-80 ℃时，荧光产率为100%。 ②pH值 含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧 光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷 状态，从而使其荧光发生变化。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素 自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
自吸收——荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光 谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在 通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。 荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐 射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光 度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。
6. 荧光强度与浓度的关系
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与
①荧光物质的吸光程度及其②发射荧光的能力有关：
F = K′（I0—I） I0 —入射光辐射强度； I —透射光辐射强度； K′—取决于荧光量子产率（Ф）。
Lambert-Beer 定律：
I I0 e
2.303bc
（3）跃迁的方式：
①无辐射跃迁： 振动弛豫、内转换、系间窜越、外转换 ②辐射跃迁： 荧光、磷光
分子荧光光谱法
去激发光 * * n
基态
在光致激发和去激发光的过程中，分子中 的价电子（ 、n电子）处于不同的自旋状 态，通常用电子自旋状态的多重性来描述
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于基态单 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm
很强的连续光源
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量 分析，不能获得光谱
大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有
较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱， 又可获得荧光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择
最佳激发波长 光物质 ex
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
205
278
萘
0.29
286
310
蒽
0.46
365
400
线状环结构比非线状
菲
结构的荧光波长长
350
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If 反而降低因为有时发生荧光猝灭效应
荧光猝灭
——荧光物质与溶剂或其它物质之间 发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度 下降或荧光效率f 下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
分子荧光光谱法实验报告范文实验报告
分子荧光光谱法实验报告实验目的1.掌握分子荧光光谱法的基本原理及实验方法；2.学会使用分子荧光光谱法测定荧光物质的荧光光谱特性；3.理解荧光强度与浓度、溶剂极性等因素的关系。
实验原理分子荧光光谱法是一种常见的光谱分析方法，它通过激发荧光物质产生荧光，再测量荧光的强度与波长，利用荧光光谱图判断荧光分子的特性与类型。
分子荧光光谱法的原理是：在分子受到激发光的能量刺激后，分子内部的电子从基态跃迁到激发态，并在激发态停留一段时间，最终回到基态时会发射出荧光光子。
荧光强度与溶液中荧光物质的浓度成正比关系，与溶剂极性、抗坐标和温度等因素有关。
实验步骤1.使用量筒测量所需溶液A的体积，加入荧光物质，并用石英量筒加入一定体积的乙腈稀释，制成荧光物质的溶液，并用紫外灯照射激发。
2.开启荧光测量仪器，调整光谱扫描参数和荧光强度测量参数，使荧光物质的荧光光谱特性能够充分体现，同时保证荧光强度不过大或过小，影响实验结果。
3.使用荧光测量仪器进行光谱扫描和荧光强度测量，获得荧光光谱图，并使用荧光稳定性方法对荧光测量仪器进行校正。
4.将荧光光谱图与标准曲线进行比对，测量出荧光物质的浓度，并计算荧光量子产率等参数。
5.通过改变溶剂极性、浓度等因素，探讨这些因素对荧光强度与荧光光谱特性的影响。
实验结果以苯并咪唑（BMD）为荧光物质，在乙腈溶液中测定荧光光谱如下：根据测定值，在BMD浓度和荧光量子产率之间绘制标准曲线如下：通过该曲线可以获得不同浓度下的BMD的荧光量子产率，进而找到最优稀释倍数。
荧光强度与溶剂极性的影响实验结果如下：对于苯并咪唑（BMD）、苯基苯酚（PNP）和芘的荧光强度测定，分别在乙腈、乙醇和水三种溶剂中进行，最终得到的结果如下：荧光物质/溶剂乙腈乙醇水BMD 6.308 3.822 2.511PNP 3.566 1.045 0.766芘 3.842 1.764 0.311由表可知，荧光强度随着溶剂极性的升高而降低。
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
分子荧光光谱法实验报告
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。
三、实验试剂和仪器
试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙醇。
(8)pH值的影响：弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上不同，是不同的型体，各具有特殊的荧光量子产额和荧光光谱。
2.激发光谱与发射光谱有什么关系？
答：发射光谱与激发光谱没有直接的关系，但是发射光谱一般要比激发光谱波长长。
3.如何进行多组分混合物的荧光分析？
答：(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定。可分别在各自的荧波长处测定，求出它们的含量。
具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。
(1)激发光谱
是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。
激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。
分子荧光光谱法
单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。
样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器： 光电倍增管。
Ⅳ、荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量 分析，但是能产生荧光的物质较少，使其 应用范围较小。
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长 差值。 荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发 射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能 量。
（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能 量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子 回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到 基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一 能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波 长λ1无关。
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc 即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质 的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
分子荧光产生机理
1.光谱类型
荧光光谱是物质分子 吸收紫外光后产生的分子 发射光谱。 2.跃迁类型
分子中原子的电子能 级跃迁，伴随振动能级的 跃迁。
3.分子的激发与失活
（1）分子的激发
基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。
分子荧光光谱法
5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫——内转换 内转换——振动驰豫到达单重激发态的 内转换 振动驰豫到达单重激发态的 最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子） 最低振动能级时，单重激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态 的不同振动能级， 荧光发射” 的不同振动能级，此过程称为 “荧光发射”。 6. 磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不 磷光发射：三重激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子） 同振动能级， 磷光发射” 同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。
三、激发光谱与荧光光谱
1、激发光谱 将激发荧光的光源用单色器分光， 将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光 波长，固定荧光发射波长， 波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质 溶液发射的荧光强度( ，以激发光的波长为横座标， 溶液发射的荧光强度 F)，以激发光的波长为横座标， 光谱图， 荧光强度为纵座标作F—l光谱图，便可得到荧光物质的 激发光谱。 激发光谱。
由于三重态寿命较长， 由于三重态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率 也高，失去激发能的可能性大， 也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观 察到溶液中的磷光现象。因此， 察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其 它去活化才能观察到某些分子的磷光。 它去活化才能观察到某些分子的磷光。 处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态， 处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪 种途径的速度快，哪种途径就优先发生。 种途径的速度快，哪种途径就优先发生。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快， 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较快， 则荧光发生几率高，强度大。 则荧光发生几率高，强度大。 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢， 如果发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比较慢， 则荧光很弱或不发生。 则荧光很弱或不发生。
荧光光谱技术介绍
荧光光谱技术概述 荧光光谱的分类与特点 荧光光谱实验技术 荧光光谱分析方法 荧光光谱技术的应用案例
contents
目 录
01
荧光光谱技术概述
定义
荧光光谱技术是一种通过测量物质吸收光后发射的荧光光谱来研究物质性质的技术。
原理
当物质吸收特定波长的光后，会通过电子跃迁至激发态，当电子返回到较低能态时，会释放出特定波长的荧光。荧光光谱的特性和强度与物质的结构和组成密切相关。
定义与原理
用于检测生物分子结构和功能，如蛋白质、DNA和细胞代谢物等。
生物医学研究
用于检测水体、土壤和空气中的污染物，如重金属、有机物和农药等。
环境监测
用于分析化学物质的结构和组成，如有机化合物、无机离子和金属配合物等。
化学分析
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养成分等。
食品工业
荧光光谱技术的应用领域
原子荧光光谱法的基本原理是原子吸收特定波长的辐射能后跃迁至激发态，随后返回基态时发射出特定波长的荧光。通过测量荧光强度，可以确定待测元素的浓度。
原子荧光光谱法在实践中需要解决一些问题，如光谱干扰、仪器噪声和基体效应等。为了提高测量的准确性和可靠性，需要采取相应的措施来减小这些因素的影响。
原子荧光光谱法通过测量待测元素原子在辐射能激发下产生的荧光强度，来定量分析待测元素在样品中的含量。其优点包括较高的灵敏度、较好的选择性以及较低的检测限。
19世纪末
荧光现象的发现。
20世纪初
荧光光谱仪器的初步研制。
20世纪中叶
荧光光谱技术开始应用于化学和生物学研究。
21世纪初
高灵敏度、高分辨率荧光光谱仪器的出现和应用领域的拓展。
分子荧光光谱法
实验二分子荧光光谱法一实验目的1.理解并掌握荧光产生的机理。
2.学会测定不同浓度物质溶液的荧光激发光谱和发荧光射光谱。
3.了解影响荧光产生的几个主要因素。
二实验原理原子外层电子吸收光子后，由基态跃迁到激发态，再回到较低能级或者基态时，发射出一定波长的辐射，称为原子荧光。
对于分子的能级激发态称为分子荧光，平时所说的荧光指分子荧光。
1.产生过程（如图1）光吸收：荧光物质从基态跃迁到激发态。
此时，荧光分子处于激发态。
内转换：处于电子激发态的分子由于内部的作用，以无辐射跃迁过渡到低的能级。
外转换：处于电子激发态的分子由于和溶剂以及其他分子的作用，以及能量转移，过渡到低的能级荧光发射：如果不以内转换的方式回到基态，处于第一电子激发态最低振动能级的分子将以辐射的方式回到基态，平均寿命约为10ns左右。
系间转换：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
振动驰豫：高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。
发生振动弛豫的时间。
图12.光谱特性激发谱：固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。
发射谱：固定激发波长，发射强度与发射波长的关系。
1) Stokes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。
发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
2) 发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。
3) 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。
4) 荧光寿命和荧光量子产率。
去掉激发光以后，荧光强度并不是立即消失，而是以指数形式衰减。
定义荧光强度降低到激发状态最大荧光强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命。
荧光寿命是个很重要的参数，可以不再对荧光的绝对强度进行测量。
三实验内容1 获得罗丹明B和2-萘酚的激发光谱和荧光光谱。
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。
法。
该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，然后在发然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。
如果这种再发射约在 s 内发生，则称为荧光；若能在生，则称为荧光；若能在 s 或更长的时间后发生，则称磷光。
分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。
荧光分析法的突出优点是灵敏度高，其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。
级。
选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，因为只有有限数量因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。
的化合物才能产生荧光。
一、基本原理一、基本原理（一）（一） 荧光光谱的产生荧光光谱的产生荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态（或更（或更高激发态）高激发态）的任一振动能级，的任一振动能级，的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
便产生荧光。
由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。
因此分子荧光波长常常比激发光长。
激发光源的波长通常是激发光源的波长通常是在紫外区，在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。
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• 荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能发 生荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点。 • 无机物通过与荧光试剂作用生成荧光螯合物而进行荧光分
析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具有两
个（或以上）与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香
结构。
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影响荧光强度的因素 一、分子结构
• 电子跃迁类型 * → 的荧光效率高，系间窜跃至 三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。 • 共轭效应 含有* → 跃迁能级的芳香族化合物 的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环 羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光 • 取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光 的产生；而给电子基会使荧光增强 • 刚性平面结构：刚性结构和共平面性可降低分子 振动，减少分子与溶剂的相互作用，使外转换能 量减少，有利于荧光的发射。
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分子荧光光谱法 Molecular fluorescence spectroscopy
杨媛媛 李亚萍 宁波大学应用固体化学研究中心 2015年11月
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目 录
1.概述 2. 荧 光 光 谱 法 基 本 原 理 及影响荧光强度的因素 3.荧光分析法的特点 4.荧光分光光度计 5.荧光分析法的应用 6.荧光测试 7.文献数据分析 8.论文撰写
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• 无辐射跃迁 • ☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能
级转至较低振动能级的过程，其效率较高。
• ☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 • ☆系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 • ☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强 度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
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1.概述
• 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以
物质所发射的荧光强度状和荧光峰对应的波长进行 行的定性分析．
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二、环境因素
• 溶剂效应：一般荧光峰波长随着溶剂极性的增大而向长波方 向移动。（极性溶剂，荧光物质与溶剂静电作用显著，从而 稳定了激发态，使荧光波长发生红移，但有少数例外）
• 温度的影响：低温条件进行荧光测定，利于分析灵敏度。
• pH的影响：对于含酸性或碱性基团的物质，pH对荧光发射
的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的改变，辐射速 度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。 • 单重态 ： 一个分子中所有电子自 旋都配对的电子状态。 • 三重态： 有两个电子的自旋不配 对而平行的状态。激发三重态能 量较激发单重态低。
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分子的激发与失活 （1）分子的激发 基态→激发态 (S1 、 S2 、激发态振动能级 ) ：吸收特 定频率的辐射，跃迁一次到位。 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发 态寿命最短的占优势。
• 光致发光（Photoluminescence）:物体依赖外界 光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发 光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射 三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之 间的跃迁，都经过激发态。而能量传递则是由于 激发态的运动。紫外辐射、可见光及红外辐射均 可引起光致发光。如磷光与荧光。
产生较大的影响
• 溶解氧的存在往往使荧光强度降低。
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★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子
不一定发射荧光或磷光；
★试样用量少和方法简便
★能提供比;光多的物理参数
★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。
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• 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级
回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。由于是相同 多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为 106~109s-1。
• 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出
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内转换 S2 S1 能 量
振动弛豫 内转换 系间跨越 T2 T1 发 射 荧 光 外转换 发 射 磷 振动弛豫 光
S0
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l1
l2
l 2
l3
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（2）激发态分子的失活
激发态分子不稳定，它要以辐射或无辐射跃迁的 方式回到基态。
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荧光分光光度计既可用于定量 分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择 激发光波长（＞250nm的紫外 光），故称为激发单色器。第 二单色器（荧光单色器）与激 发光入射方向垂直，并选择荧
光波长，可提高方法的选择性
和准确度。
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样品
1. 固体 Zn、Cd、稀土金属、 具有大共轭体系
四 面 皿光 比 色
2. 液体
测试注意点
1. 发射波谱 激发波长选择(参考文献 lex) 发射波长范围设置 (lex ~ 小于2lex)
应避开λex光的 n倍处!
2. 激发波谱 发射波长选择(lem最佳发射波长) 激发波长范围设置(220 ~ 小于 lem) 3. 测试配合物的荧光前要先测试合成配合物所用配体的荧光性质。