时间分辨荧光免疫法在梅毒螺旋体抗体筛查中应用探讨
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论㊀㊀著
时间分辨荧光免疫法在梅毒螺旋体抗体筛查中应用探讨
谭玉华1,雷泽洪2,刘㊀灿1,胡爱武1,赵凡一1
(1.广州市丰华生物工程有限公司体外诊断试剂研发中心,广东广州510730;
2.江门市中心医院检验科,中山大学附属江门医院,广东江门529000)
㊀㊀摘㊀要:目的㊀对双抗原夹心时间分辨荧光免疫法(T R F I A)在梅毒螺旋体特异性抗体(抗GT P)临床筛查中的价值进行评价,并建立较合理的抗GT P筛查报告流程.方法㊀采用T R F I A对7975例临床血清标本进行检测,初筛阳性样本再采用梅毒甲苯胺红不加热血清试验(T R U S T)和T P明胶凝集试验(T P P A)进行复检.经S P S S13.0和M i c r o s o f tE x c e l软件对结果进行统计分析.结果㊀7975例临床血清标本中,T R F I A共筛检出248例抗GT P阳性样本.初检阳性样本中,T R U S T检出阳性76例;T P P A检出阳性233例,阴性15例,T P P A 与T R F I A的阳性符合率为93.95%.T R F I A试剂抗GT P浓度在13.50m I U/m L以上时,T P P A与T R F I A检测结果的符合率为100%.结论㊀T R F I A筛查抗GT P较高的灵敏度,但阳性样本应根据抗GT P浓度确定是否需要采用高特异性的抗GT P试剂进行复检验证,复检实验可以选择T P P A试剂,对复检验证后为阳性的样本,应报告T R U S T试剂滴度结果,以便辅助临床诊断和治疗.
关键词:时间分辨荧光免疫法;㊀凝集试验;㊀梅毒甲苯胺红不加热血清试验;㊀梅毒螺旋体
E v a l u a t i o no f t h e t i m eGr e s o l v e d f l u o r e s c e n c e i m m u n o a s s a y f o r d i a g n o s i s o f s y p h i l i s i n t h e c l i n i c a l s c r e e n i n g t e s t
T A NY u h u a1,L E IZ e h o n g2,L I UC a n1,HUA i w u1,Z HA OF a n y i1
(1.R&D C e n t e r o f I V Dr e a g e n t s,G u a n g z h o uF e n g h u aB i o e n g i n e e r i n g C o.,L t d.,
G u a n g z h o u,G u a n g d o n g510730,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b o r a t o r y,J i a n g m e n
C e n t r a lH o s p i t a l,A f f i l i a t e dJ i a n g m e n H o s p i t a l o f S u nY a tGs e nU n i v e r s i t y,
J i a n g m e n,G u a n g d o n g529000,C h i n a)
A b s t r a c t:O b j e c t i v e㊀T o e v a l u a t i o n t h e v a l u e o f d o u b l e a n t i g e n s a n d w i c hT i m eGr e s o l v e dF l u o r o i m m u n o a sGs a y(T R F I A)f o rd i a g n o s i so f s y p h i l i s i nt h ec l i n i c a l s c r e e n i n g t e s t,a n dd e v e l o p a nr e l i a b l ea n t iGT Ps e r o l o g y s c r e e n i n gp r o t o c o l.M e t h o d s㊀7975s y p h i l i ss e r u m s a m p l e sw e r e p r e l i m i n a r y s c r e e n e db y t h eT R F I A k i t s.T h e n,p o s i t i v e s a m p l e sw e r e r e c h e c k e db y t o l u l i z e dr e du n h e a t e ds e r u mt e s t(T R U S T)a n dt r e p o n e m a p a l l iGd u m p a r t i c l e a g g l u t i n a t i o na s s a y(T P P A).T h e r e s u l t sw e r e s t a t i s t i c a l l y a n a l y z e db y s o f t w a r eS P S S13.0a n d M i c r o s o f tE x c e l.R e s u l t s㊀A m o n g7975s a m p l e s,248s a m p l e sw e r e p o s i t i v e b y u s i n g t h eT R F I A.O f t h e s e p o sGi t i v e s e r a,76s a m p l e s c o u l db ed e t e c t e db y T R U S T,233s a m p l e s c o u l db ed e t e c t e db y T P P Aa n d15s a m p l e s c o u l dn o t b e d e t e c t e db y T P P A.T h e p o s i t i v e c o i n c i d e n c e r a t e o fT R F I Aa n dT P P A w a s93.95%.W h e na n t iGT Pr e s u l t s o fT R F I A w e r e>13.50m I U/m L,a l l s a m p l e sw e r eT P P A p o s i t i v e.C o n c l u s i o n㊀T R F I Ai s a h i g h l y s e n s i t i v e s c r e e n i n g a s s a y f o rd e t e c t i n g a n t iGT P,w e r e c o m m e n d e ds c r e e n i n g a n t iGT Pb y T R F I A,a n dd e t e r m iGn i n g w i t ha n o t h e r h i g h l y s p e c i f i c a n t iGT Pt e s t i n g t oc o n f i r mt h e r e s u l t s a c c o r d i n g t o i t sv a l u e s.T P P Ac a nb e s e l e c t e d f o r t h ev a l i d a t i o ne x p e r i m e n t.W h e nT P P Ac o n f i r m e d p o s i t i v e r e s u l t s,T R U S Tt i t e r r e s u l t ss h a l l b e r e p o r t e d t o a s s i s t a n t c l i n i c a l d i a g n o s i s a n d t r e a t m e n t.
K e y w o r d s:t i m eGr e s o l v e d f l u o r o i m m u n o a s s a y;㊀t r e p o n e m a p a l l i d u m p a r t i c l ea g g l u t i n a t i o na s s a y;㊀t o l uGl i z e d r e du n h e a t e d s e r u mt e s t;㊀t r e p o n e m a p a l l i d u m
㊀㊀20世纪80年代,梅毒在我国重新出现,90年代末以来,全国梅毒报告病例数明显增加,流行呈现快速上升趋势.2009年年发病率为24.66/10万,发病率年均增长14.3%;先天梅毒报告发病率为64.41/10万活产数,发病率年均增长49.2%;梅毒报告病例数在我国甲乙类传染病报告中居第三位[1].我国梅毒流行形势日益严峻,梅毒可通过性㊁血液和母婴途径传播,但感染梅毒后只要及早发现并进行规范治疗是可以治愈的.加强对梅毒的普查,已成为防止该疾病蔓延的重要手段.梅毒螺旋体(t r e p o n e m a p a l l iGd u m,T P)是导致梅毒的病原体,对人血清或体液梅
毒螺旋体抗体(抗GT P)的检测是梅毒诊断的重要依据.目前梅毒检测已在国内外作为常规术前检查项目,临床常用的方法有梅毒甲苯胺红不加热血清试验
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(s y p h i l i s t o l u i d i n e r e d u n t r e a t e d s e r u m t e s t, T R U S T)㊁酶联免疫法(e n z y m eGl i n k e di m m u n o s o rGb e n t a s s a y,E L I S A)和T P明胶凝集试验(t r e p o n e m a p a l l i d u m p a r t i c l ea s s a y,T P P A)等.T R U S T检测血清或血浆中的反应素,用于献血员筛选㊁梅毒患者辅助诊断及疗效评价,试验操作简便㊁费用较低,但假阳性率较高,阳性结果需用特异性T P试验确认.
E L I S A有敏感性高,特异性好,适合梅毒的大规模筛查,但灵敏度和特异性不及T P P A法,且存在一定的假阳性[2].T P P A法的特点是方法特异㊁假阳性率低等,检测试剂成本高,操作较烦琐,耗时较长,因此不适合大量标本的筛查[3].铕标记时间分辨荧光免疫分析法(t i m eGr e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y,T R
F I A)是一种非放射标记超微量免疫检测技术,降低了非特异性信号,达到了极高的信噪比,具有敏感性高㊁重复性好㊁特异性强㊁定量范围宽㊁检测速度快㊁标记物稳定等突出优点.本研究对T R F I A在抗GT P筛查中临床应用价值及其血清学筛查报告流程进行了探讨.1㊀材料与方法
1.1㊀标本来源㊀按照«全国临床检验操作规程»(第三版)进行血液标本采集与处理,收集了7975份门诊或住院患者进行抗GT P筛查的血清样本.1.2㊀主要试剂与仪器㊀梅毒T R U S T诊断试剂(北京万泰生物药业股份有限公司),抗GT P检测试剂盒(T P P A)(日本富士瑞必欧株式会社),抗GT P测定试剂盒(T R F I A)和A u t o T R F I AG8型自动荧光免疫分析仪(广州市丰华生物工程有限公司).
1.3㊀方法
1.3.1㊀T R F I A试剂原理㊀应用双抗原夹心T R F I A 法.用嵌合型多表位基因重组T P抗原(含T P47㊁T P 17㊁T P15优势片段)包被固相,用铕(E u)标记嵌合型多表位基因重组T P抗原(含T P47㊁T P17㊁T P15优势片段)作为标记物(T PGE u),在固相抗原微孔反应板中依次加入一定体积的校准品及待测样本,其中的抗GT P与固相抗原形成 T PG抗GT P 复合物.洗涤后再加入标记物,标记物与已结合的 T PG抗GT P 复合物形成 T PG抗GT PGT PGE u 的复合物.经洗涤后加入增强液,复合物上的铕离子(E u3+)被增强液解离到溶液中,并与增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物.荧光强度与校准品㊁待测样本中的抗GT P含量成正比.检测方法严格按照试剂盒和仪器说明书操作,T R F I A试剂的参考值采用2.50m I U/m L,小于2.50m I U/m L判断为阴性反应,否则为阳性反应.1.3.2㊀T P P A试剂原理㊀将T P(N i c h o l s株)的精制菌体成分包被在人工载体明胶粒子上.这种致敏粒子和样本中的抗GT P进行反应发生凝集,产生粒子凝集反应(p a r t i c l e a g g l u t i n a t i o n t e s t,P A)法,由此可以检测出血清和血浆中的抗GT P,并且可用来测定抗体效价.检验结果的解释:在判定用观测板上静置微量反应板,观察粒子的反应图象.将反应图象与介质对照的图象进行比较.粒子成纽扣状聚集,呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形判为(-);粒子形成小环状,呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形判为(ʃ);粒子环明显变大,其外周边缘也不均匀且杂乱地凝集在周围判为(+);产生均一的凝集,凝集粒子在底部整体上呈膜状延展判为(++).
1.3.3㊀T R U S T试剂原理㊀采用性病实验室玻片试验(v e n e r e a l d i s e a s e r e s e a r c h l a b o r a t o r y t e s t,V D R L)抗原重悬于特制的甲苯胺红溶液中,当待测血清中存在反应素时,能与V D R L抗原发生凝集反应,出现肉眼可见的粉红色凝块.检验结果的解释:阳性反应为可见中等或较大块的粉红色凝块;弱阳性反应为可见较小的,明显的粉红色凝块;阴性反应为可见粉红色均匀的沉淀物无凝集物.效价判定为以呈现明显凝集反应的最高稀释度作为该血清的凝集效价.1.3.4㊀抗GT P筛查与复检㊀T R F I A试剂对7975例临床样本进行筛查检测,检测值等于或大于2.00m I U/m L的阴性样本以及阳性样本,再采用T P P A和T R U S T2种试剂同时进行复检.
1.4㊀统计学处理㊀T R F I A测量所得荧光计数采用T R F I A仪上随机配备的分析软件进行数据分析.其他统计结果数据采用S P S S13.0和M i c r o s o f tE x c e l 软件进行统计分析.
2㊀结㊀㊀果
2.1㊀T R F I A试剂抗GT P筛查结果㊀T R F I A试剂在7975例临床样本中初筛出抗GT P阳性样本248例(占3.11%),抗GT P浓度值在2.50~266.31m I U/ m L间.检测为阴性的样本7727例,抗GT P浓度值在0.05~2.43m I U/m L间.
2.2㊀T R F I A试剂抗GT P阴性样本的分布情况㊀7727例阴性样本的检测值呈现正偏态分布,百分位数P90㊁P95和P99分别为0.15,0.29,0.98m I U/m L.其中12例大于或等于2.00m I U/m L的阴性样本经T P P A试剂和T R U S T试剂检测均为阴性.结果详见表1.
2.3㊀T R F I A试剂抗GT P阳性样本与T R U S T㊁T P P A 复检结果分析㊀在248例T R F I A试剂抗GT P阳性样本中,T R U S T试剂共检出76例阳性样本,其T R F I A 试剂抗GT P浓度为18.51~263.51m I U/m L,T R U S T 试剂与T R F I A试剂的阳性符合率为30.65%.76例T R U S T试剂阳性样本经T P P A试剂检测均为阳性. T R U S T试剂结果滴度倒数与T R F I A试剂抗GT P浓度无相关性,但以抗GT P浓度为组距,T R U S T试剂阳性检出例数近似正态分布,在75.01~100.00m I U/
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m L组T R F I A㊁T R U S T和T P P A试剂检出率均最高.T P P A试剂共检出233例阳性,15例阴性,T PGP A试剂与T R F I A试剂的阳性符合率为93.95%. T R F I A试剂抗GT P浓度在13.50m I U/m L以上时, T P P A试剂与T R F I A试剂检测结果的符合率为100%.而在39例抗GT P小于13.50m I U/m L的样本中,在2.50~3.50m I U/m L内的样本10例有4例为T P P A试剂阳性;3.51~13.50m I U/m L内的样本29例,T P P A试剂阳性20例(68.97%),且随着抗GT P浓度的升高,T P P A试剂的检出率也增高.结果详见表2.
表1㊀㊀7727例T R F I A抗GT P阴性样本的浓度值分布抗GT P(m I U/m L)频数频率(%)累积频数累积频率(%)0.05~631681.74631681.740.21~94312.20725993.940.41~2062.67746596.610.61~1001.29756597.900.81~580.75762398.651.01~320.41765599.071.21~190.25767499.311.41~220.28769699.601.61~150.19771199.791.81~40.05771599.842.01~80.10772399.952.21~20.03772599.972.41~2.4320.037727100.00
表2㊀㊀T R F I A试剂阳性样本的T R U S T和
㊀㊀㊀T P P A试验结果(n)
抗GT P(m I U/m L)T R F I A T R U S T T P P A 2.50~55240
25.01~25725
50.01~441744
75.01~582358
100.01~291129
125.01~19919
150.01~626
175.01~737
200.01~202
225.01~111
250.01~266.31212
合计248762333㊀讨㊀㊀论
㊀㊀为了控制梅毒的传播,医院规定手术输血及各种创伤性检查的患者必须进行T P的血清学检验.一旦出现假阳性或假阴性结果,对患者及亲友都有重大影响,亦能引起医疗纠纷.因此选择敏感性和特异性均高的检测方法,并建立合适的复检流程极其重要.
T P的体外培养技术迄今仍未解决,因此微生物检查和血清学筛查成为目前筛选和确诊梅毒感染的主要途径.随着T P全基因序列的破译以及基因工程技术的进步,当前T P重组抗原的基因研究已由单基因发展到多表位嵌合基因,部分基因研究已通过原核生物表达成功,解决了T P血清学研究的抗原瓶颈问题.有研究[4]报道T P基因重组抗原在梅毒筛查中具有相当高的灵敏度和特异性.
本研究中,T R F I A试剂采用嵌合型多表位抗原的双抗原夹心法,检测抗GT P样本7975例,采用参考值2.50m I U/m L判断,T R F I A试剂检出7727例阴性样本(96.89%),阴性样本浓度值的百分位数P90㊁P95和P99分别为0.15,0.29,0.98m I U/m L,表明T R F I A试剂检测阴性样本的本底低,分辨率高.T RGF I A试剂初筛阳性样本248例,占样本总数的3.11%,高于文献[5G6]的报道,这可能与受检的群体有关.
T R F I A试剂初筛出的248例阳性样本中,经T R U S T试剂检测有76例为阳性,且T P P A试剂检测为阳性,T R U S T试剂与T R F I A试剂符合率为30.65%.T R U S T阳性检出率低于T R F I A试剂,这由于T R U S T试剂检测的反应素滴度与病变的活动性有关.T R F I A试剂初筛阳性样本中,T P P A试剂与T R F I A试剂的符合率达93.95%,仍有6.05%的样本存在结果不一致,不一致率低于文献[5,7]的报道,这些结果不一致的样本集中在皮肤患者㊁肿瘤患者㊁孕产妇和老年人.产生结果不一致的原因,可为方法学或试剂使用的抗原差异等造成,T R F I A试剂采用的是嵌合型多表位基因重组T P抗原双抗原夹心法, T P P A试剂采用T P(N i c h o l s株)精制菌体成分P A 法.T R F I A试剂产生的部分假阳性,可能由于在双抗原夹心法测定抗GT P中,为使小分子基因工程抗原较好地吸附在微孔上,常使用人血清白蛋白作为桥联接,当人体中针对人血清白蛋白抗原位点产生的抗体或干扰蛋白,可能会产生假阳性.研究报道[8]在孕产妇㊁肿瘤患者以及老年人中抗T P抗体筛查试验假阳性的现象尤甚.特别是妊娠引起的孕产妇血清抗GT P 假阳性还可累及新生儿血清抗GT P假阳性[9],可能是高浓度的甲胎蛋白形成二聚体产生的非特异性吸附有关.由于疾病因素,如直肠癌㊁肺癌㊁胰腺癌㊁膀胱癌㊁腹腔内膜癌㊁子宫内膜癌㊁乳腺癌㊁卵巢癌㊁糖尿病㊁肺结核㊁红斑狼疮㊁水痘㊁麻疹㊁呼吸道感染㊁类风湿性关节炎㊁风湿性心脏病㊁生殖器疱疹㊁丙型肝炎㊁
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人类免疫缺陷病毒㊁海洛因成瘾等可使患者体内含有治疗性抗体㊁嗜异性抗体㊁自身抗体㊁类风湿因子㊁甲胎蛋白等,梅毒血清学实验可能会造成假阳性[
5G13]
.老年人(特别大于50岁)中的患者中,由于所患的基础疾病可能使机体释放诱导产生抗类脂抗体和/或抗梅毒螺旋体抗体交叉的抗原;也有可能由于老年患者体内人类宿主相关的螺旋体(口腔螺旋体㊁皮肤相关的螺旋体㊁肠道螺旋体)共生,诱导产生抗属㊁群或科特异性抗原的交叉反应抗体,在老年人患者的梅毒血清学实验可能会出现几种梅毒血清学试验方法检测
结果同时阳性的假阳性[
14]
.因此使用不同试剂对同一份样本检测,可能会得到不同的检测结果.建议实验室在发给临床医生的检测报告注明所用试剂特征.本研究中,T R U S T 试剂的滴度倒数与T R F I A
试剂抗GT P 浓度无相关性,不能将抗GT P 浓度用于疗效评估.但以抗GT P 浓度为组距,T R U S T 阳性检出
例数近似正态分布,在75.01~100.00m I U /m L 组
T R F I A ㊁T R U S T 和T P P A 试剂检出率均最高,可能与受检者梅毒所处的病期有关.抗GT P 浓度在13.50m I U /m L 以上时,T R F I A 试剂与T P P A 试剂检测结
果的符合率为100%,为了减少假阳性,可以适当的提高参考值,但值得注意的是在低值2.50~3.50m I U /m L 区间,仍有4例T P P A 阳性,29例3.51~13.50
m I U /m L 的样本,T P P A 试剂阳性率达68.97%,随着抗GT P 浓度的升高,T P P A 试剂的检出率也增高.因实验室结果有一定的假阳性率和假阴性率,所以抗G
T P 检测只能作为诊断的参考依据,并要注意定期复查,才能避免梅毒化验结果假阳性或假阴性,造成误
诊.根据本研究结果分析,可以建立较合理的T R G
F I A 试剂筛查抗GT P 报告流程,当抗GT P 浓度小于2.50m I U /m L 的样本,
结合临床信息可以报告为阴性;对等于或大于2.50m I U /m L 的标本可以采用
T P P A 试剂进行复检,当T P P A 试剂检测为阴性时,
还是应建议定期监测抗GT P ,观察抗GT P 浓度的动态变化,避免漏检并结合临床信息排除假阳性.T P P A 试剂复检阳性,结合临床信息可以报告为阳性.对复检验证后报告为阳性的样本,应报告T R U S T 试剂滴度结果,以便辅助临床诊断和治疗.参考文献
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论㊀㊀著
广州地区腹泻儿童沙门菌感染状况调查及耐药性分析
高秀蓉,张㊀力,王洁琳,高㊀飞,龙㊀燕
(广州市妇女儿童医疗中心,广东广州510623
)㊀㊀摘㊀要:
目的㊀了解广州地区腹泻儿童沙门菌的感染状况及其耐药性,为指导临床用药提供依据.方法㊀采集2015年1月至2017年12月某医院腹泻患儿粪便标本3757例进行沙门菌培养,分析沙门菌检出情况以及沙门菌的血清分型;再采用纸片扩散(K GB )法检测其抗菌药物敏感性.结果㊀共检出271株沙门菌,
总检出率为7.21%;发病时间集中在7-10月份,共检出180株(66.42%);感染以婴幼儿为主,3岁以下婴幼儿检出
199株(73.44%).271株沙门菌鉴定出14种血清型,其中以鼠伤寒沙门菌(181株,66.78%.)与肠炎沙门菌
721 国际检验医学杂志2018年第39卷Z Ⅰ。