大叶藤黄叶片角质层的酶分离技术生态学杂志

大叶藤黄叶片角质层的酶分离技术3王博轶　冯玉龙33(中国科学院西双版纳热带植物园昆明分部,昆明650223)摘　要　角质层运输特征的研究在生态学、环境和农用化学等方面都具有非常重要的意义,完好地分离角质层是进行这方面研究的前提。

本文以生长在西双版纳热带雨林中的大叶藤黄为材料,探讨了角质层的酶分离技术。

结果表明,30℃时用2%(w/v ),p H 310的果胶酶和纤维素酶溶液浸泡大叶藤黄叶圆片9h ,叶圆片边缘角质层分离,浸泡5d 可分离到完整的角质层,角质层在硼酸盐缓冲液(0101mol ・L -1,p H 910)中充分浸泡数日去除石炭酸,空气中干燥,室温下于聚乙烯的盒子保存备用。

关键词　角质层,酶分离,大叶藤黄,西双版纳中图分类号　Q945 文献标识码　A 文章编号　1000-4890(2004)03-0141-03E nzym atic isolation of leaf cuticles of Ga rcinia xanthochymus .WAN G Boyi ,FEN G Yulong (Kun 2ming Devision ,Xishuangbanna T ropical Botanical Garden ,Chinese Academy of Sciences ,Kunming 650223,China ).Chinese Journal of Ecology ,2004,23(3):141～143.Investigation of cuticular transport physiology is of great importance for ecological ,environmental and agrochemical research.Isolation of intact cuticles is a crucial prerequisite for these studies.Relative studies have not been seen in our country.The method of enzymatic isolation of cuticles was described in this paper.K ey w ords plant cuticle ,enzymatic isolation ,Garcinia x anthochym us ,Xishangbanna.3中国科学院“百人计划”资助项目。

33通讯作者收稿日期:2003-03-19 改回日期:2003-05-061　引　言角质层是植物叶表面由角质和蜡质组成的膜状结构,并由果胶质连结,覆盖在表皮细胞外表面的细胞壁上,对植物起着机械防护和失水保护的作用。

角质层运输特征的研究在生态学、环境和农用化学等方面都具有非常重要的意义。

对生长在大气环境中的植物来讲,角质层是一个防止非可控的水分丢失的屏障[4]。

在水分胁迫条件下,气孔将会关闭,角质层蒸腾的速度决定了植物丢失到大气中的水分的量。

角质层的透性可以影响植物对雾露水、农药、微肥等的吸收。

喷雾到叶片表面的农用化学品必须要穿过角质层才能到达它的作用位点[1]。

在生态毒物学方面,为了估算沉积在叶片表面的环境中有毒的化学物最终的吸入量,测量角质层的通透性是很有必要的[9]。

而要研究角质层的这些特征,完好地分离角质层是重要的前提。

为探讨全球环境变化导致的雾露水减少对该区生态系统结构、功能等的影响,作者研究西双版纳地区热带植物对雾露水吸收能力的差异,分离了大量植物的角质层,本文介绍角质层的酶分离方法,快速、灵敏且操作简单。

2　材料与方法以生长在西双版纳沟谷林中的大叶藤黄(Garci nia x anthochym us )为材料。

试验时取相近环境中相近年龄的成熟叶片,用打孔器打孔得到直径15mm 的叶圆片,随机分组,每组20片。

进行如下处理:(1)不同酶浓度处理:以0101mol ・L -1柠檬酸盐缓冲溶液(p H 310)配成015%、1%、2%、3%、5%、8%(w/v )的果胶酶与纤维素酶溶液,30℃下浸泡叶圆片;(2)不同p H 值处理:分别以0101mol ・L -1、PH 为310、315、410、415、510、515、610、615、710的柠檬酸盐缓冲溶液配成2%(w/v )的果胶酶与纤维素酶溶液,30℃下浸泡叶圆片;(3)不同温度处理:以0101mol ・L -1柠檬酸盐缓冲溶液(p H 310)配成2%(w/v )的果胶酶与纤维素酶溶液,分别于15℃、20℃、30℃、40℃下浸泡叶圆片。

每一处理3个重复,各参数均以平均值加减1个标准误差表示,用t 检验不同处理之间的差异,P <0105,差异显著。

本文以用解剖镊子能剥离开叶圆片边缘角质层生态学杂志Chinese Journal of Ecology 2004,23(3):141～143(而不是角质层完全分离脱落)为标准判断角质层分离与否。

3　结果与分析在酶浓度为2%(w/v )、p H 310、温度为30℃的条件下,叶圆片刚刚浸泡时浮于溶液表面,溶液慢慢由叶圆片四周向中间渗透,可观察到四周颜色变深,中间较浅。

随着溶液的渗透,叶圆片逐渐下沉变软,浸没于溶液当中。

约9小时后,20个叶圆片边缘角质层几乎全部分离。

继续浸泡约5天后,整个叶圆片颜色完全变深,角质层基本完全分离。

这时,可用镊子夹住角质层边缘,轻轻撕下,有些则可自动脱落。

分离后用去离子水洗以除去粘附的细胞碎片。

增加酶浓度可以减少分离角质层所需的时间(图1)。

酶浓度小于2%时,随浓度的增加,角质层分离所需时间减少较快;而当酶浓度大于2%时,对角质层分离所需时间的影响则不很明显。

2%的酶浓度较合适,此浓度下大约9小时后角质层可分离。

图1　酶浓度(w /v)对分离大叶藤黄叶片上表皮角质层所需时间影响Fig.1　E ffect of enzyme concentration (w /v)on the time required toisolate the upper epidermis cuticle of Garcinia xanthochymus leaves 注:数据点为平均值±标准误(n =3),下同。

不同大写字母表示不同浓度处理间性差显著异(P <0105) 叶圆片浸泡3h 时还无角质层分离,随浸泡时间的延长,角质层分离的叶圆片增多,9h 后p H 310的酶液中的20个叶圆片角质层几乎全部分离(图2)。

酶液的p H 对角质层的分离速度有显著的影响,浸泡相同时间后,p H 值越低角质层分离的叶圆片数量越多,9h 后p H 310、315、410、415、510、515、610的酶液中角质层分离的叶圆片数分别为1916667±013333;1616667±013333;15±015774;1216667±013333;11±015774;613333±013333;013333±013333(图2)。

延长浸泡时间,p H 615的酶液中大叶藤黄叶片角质层也能分离,这与Sch nherr [8]的结果不同,p H 610条件下榕树叶片角质层已不能分离。

p H 710时,即使浸泡时间再长大叶藤黄叶片角质层也不会分离。

图2　pH 对分离大叶藤黄叶片上表皮角质层所需时间的影响Fig.2　E ffect of pHon the time required to isolate the upper epidermiscuticle of Garcinia xanthochymus leaves 角质层分离的速度随温度的升高而显著增加,温度较低时(15℃～20℃)增加较快,温度较高时(20℃～40℃)增加速度变缓(图3)。

图3　温度对分离大叶藤黄叶片上表皮角质层所需时间的影响Fig.3　E ffect of temperature (℃)on the time required to isolate theupper epidermis cuticle of Garcinia xanthochymus注:不同大写字母表示不同温度处理间差异显著(P <0105)4　讨　论角质层酶分离过程中,一些酸性化合物如石炭241 生态学杂志　第23卷　第3期　酸、脂肪酸,会从细胞中释放出来,并被角质层吸收,被吸收的石炭酸会影响角质层透性[8]。

这些物质的释放量随浸泡时间的延长而增多,故在角质层酶分离过程中应尽量缩短叶圆片的浸泡时间,以减少这些物质对角质层透性的影响。

本研究表明,增加酶的浓度(图1),降低酶溶液的p H值(图2)和升高温度(图3),均可加快角质层分离速度,这与Sch nherr[8]的结果是较一致的。

2%(w/v)的果胶酶和纤维素酶浓度,p H310,30℃条件下可以较好地分离大叶藤黄成熟叶片的角质层,在此条件下也能较好地分离黄花胡椒、红雾水葛成熟叶片的角质层(结果未列出)。

角质层分离所需时间与植物种类和叶片年龄紧密相关,黄花胡椒、红雾水葛叶片角质层分离明显比大叶藤黄快,1%酶浓度下榕树叶片角质层分离速度明显比大叶藤黄快[8]。

增加酶浓度可以减少角质层分离所需时间,但酶浓度大于某一值时,酶浓度的效应不显著(图1),可依据实际情况选择适宜的酶浓度。

研究表明,40℃到50℃之间角质层会发生相变,引起水分通透性的不可逆转的增加[6,7],故分离角质层时温度不能高于40℃。

降低酶溶液的p H可以加快角质层分离速度(图2),但分离角质层时p H不能低于310,因p H低于310时角质层中的一些物质不稳定[3]。

在p H310的条件下角质层分离快,细胞内释放出的石炭酸等不能电离,角质层对它们的吸收较少[8],分离到的角质层结构、透性及表面的石蜡层均未受到分离过程的影响。

为去除石炭酸等对角质层透性的影响,分离下来的角质层需在硼酸盐缓冲液(0101mol・L-1,p H 910)中充分浸泡数日,期间定期更换硼酸溶液。

取出角质层于空气中干燥,并于室温下存放于聚乙烯盒中,3个月后可以用于角质层透性测定(新分离的角质层的透性比其实际透性高[2])。

室温下将角质层放于氯仿/甲醇(1:1)中10分钟,可去除其表面的蜡质[5]。

在叶圆片的酶液浸泡过程中,溶液很容易长霉。

15℃时,长霉较慢,当温度高于20℃时,浸泡1至2天,肉眼即可观察到霉菌。

为抑制霉菌的生长可在酶溶液中加入叠氮化钠等,条件允许时也可采用其它无菌操做技术。

参考文献[1]　Hull HM.1970.Leaf structure as related to absorption of pesti2cides and other compounds[J].Res.Rev.,31:1～150[2]　K irsch T,et al.1997.Cuticular permeability of the three treespecies Prunus laurocerasus L.,G ingo biloba L.and J uglans regiaL.:Comparative investigation of the transport properties of intactleaves,isolated cuticles and reconstituted cuticular waxes[J].J.Ex p.Bot.,4:1035～1045.[3]　Riederer M,Sch nherr J.1984.Accumulation and transport of(2,42dichlorophenoxy)acetic acid in plant cuticlesⅠ.Sorption in thecuticular membrane and its components[J].Ecotoxicol.Envi2ron.S af ety,8:236～247.[4]　Riederer M,Schreiber L.2001.Protecting against water loss:anal2ysis of the barrier properties of plant cuticles[J].J.Ex p.Bot.,52:2023～2032.[5]　Sch nherr J.1976.Water permeability of isolated cuticular mem2branes:the effect of cuticular waxes on diffusion of water[J].Planta,131:150～164.[6]　Sch nherr J,Eckl K,Gruler H.1979.Water permeability of plantcuticles:the effect of temperature on diffusion of water[J].Plan2ta,147:21～26.[7]　Sch nherr J,Merida T.1981.Water permeability of plant cuticu2lar membranes:the effect of humidity and temperature on perme2ability of non2isolated cuticles of onion bulb scales[J].Plant,Cell Envi ron.,4:349～354.[8]　Sch nherr J,Riederer M.1986.Plant cuticles sorb lipophilic com2pounds during enzymatic isolation[J].Plant Cell Enviorn.,9:459～466.[9]　Sch nherr J,Riederer M.1989.Foliar penetration and accumula2tion of organic chemicals in plant cuticles[J].Rev.Envi ron.Contam.Toxicol.,108:1～70.作者简介　王博轶,女,1978年出生,在读硕士研究生。