L-亮氨酸的初步研究及菌种选育
L-亮氨酸的初步研究及菌种选育
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酗 霾蚕 ～ … 一 一 一 … 一… 、
２７（ １期 ０． 第４ ） ０ 总 ７ ４
Ｌ一亮 氨酸 的初 步研究 及菌种选 育
王 文风 徐 玲 王 瑞 明
（ 山东轻工业学院食 品与生物 工程学院 济南 ２ ０ ５ ） ５３３
Ｋｅ ｗｏ ｄ ｙ ｒ ｓ： Ｌ．ｅ ｃ ｎ ｍｅａ ｏ ｉ ｅ ｌｔｏ ｃ ｎ ｓ １ｕ ｉｅ ｔ ｂ ｌｃｒ ｇｕ ａｉ ｎ ｍｅ ｈａ ｉｍ ｂ ｅ ｄｎｇ ｒｅ ｉ
氨 基 酸是 构 成 蛋 白质 的基 本 单 位 ，在 生物 体
结晶或结 晶性粉末 ， 微苦 ， 不溶于氯仿和 甲醇 ， 乙
１１ 一 ． Ｌ 亮氨酸 的 用途
ｌ ｌ 年 经 Ｐ ｏ ｓ 首先从奶酪 中分离 出来的 ，以 ９ ８ ｒｕ ｔ
后 Ｂ ａｏ ｎ ｔ 肌 肉与 羊 毛 的 酸水 解 物 中得 到 其 ｒｃ ｎ ｏ 从
Ｌ 亮氨酸与 Ｌ 异亮氨酸 （ —ｏｅｃ ｅ ， 缬 ． 一 Ｌｉ ｌ ｉ ） ． ｓ ｕｎ Ｌ 氨酸 （・ａｉｅ 的分子 结构 中含有 一个 甲基 侧链而 Ｌｖｌ ） ｎ
Ｂ Ａ 。Ｌ 亮氨酸是人与动物 自身不能合成而必 Ｃ Ａ） 一 须依赖外源供给的八大必须氨基酸之一，是临床
选用的复合结晶氨基酸静脉注射液不可缺少的原 料。 一 Ｌ 亮氨酸对维持危重病人的营养需要 ， 抢救患 者生命起着积极作用。亮氨酸还在调节氨基酸与蛋
Ｌ一 氨 酸 的 相 对 分 子 质 量 为 ｌ ． 亮 １１ ３ ８，含
ｂ ｏ ｙ ｈ ｓｓｐ ｔ ｗａ ｎ ｔｂ ｌ ｇ ｌｔ ｎ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ． ｅ ａ ｔ ｏ ｉ ｌ ｘ ｏ ｎ ｅ ｅｂ ｅ ｄ ｎ ｔ ｔ ｇ ｅ ｉ ｓ ｔ ｅ ｉ ａｈ ｙ ａ ｄ ｍｅ ａ ｏ ｉ ｒ ｕ ａｉ ｃ ａ ｉｍ Ｔｈ ｕｈ ｒ ｃ ｅ ｏ ｍａ ｎ ｙ ｅ ｐ ｕ ｄ ｄ ｔ ｒ ｅ ｉ ｇ ｓｒ ｅ ｉ ｓ ｈ ａ ａ ｏ ｔ ｏ ｔ ｂ ａ ｎ Ｌ ｌｕ ｉ ｅｈ ｇ — ｒ ｄ ｃｎ ｔ ｉ ｓｂ ａ ｓ ｆ ｔｂ ｌ ｏ ｔ １ ｂ ｕ ｗ ｏ ｔｉ ・ ｃ ｎ ｉ ｈ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｓ ａ ｎ ｙ ｍｅ ｎ ａ ｏ ｉ ｃ ｎ ｒ ． ｈ ｏ ｅ ｒ ｏ ｍｅ ｃ ｏ
一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法[发明专利]
![一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/1cbeae2153d380eb6294dd88d0d233d4b04e3f59.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811647345.0(22)申请日 2018.12.30(71)申请人 新疆阜丰生物科技有限公司地址 830026 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市经济技术开发区（头屯河区）甘泉堡工业区申请人 天津科技大学 吉林大学(72)发明人 包鑫 徐庆阳 李德衡 王健 张宗华 杨瑞丽 张玉福 (51)Int.Cl.C12P 13/06(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12R 1/13(2006.01)(54)发明名称一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法(57)摘要本发明属于氨基酸生产技术领域，公开了一种提高L -亮氨酸发酵产量的方法，其包括如下步骤：将黄色短杆菌接入到含有生物素的发酵罐培养基中进行发酵。
本发明通过对L -亮氨酸代谢途径进行分析，优化了发酵培养基以及发酵步骤，提高了发酵产酸量。
权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 109609564 A 2019.04.12C N 109609564A1.一种提高L -亮氨酸发酵产量的方法，其包括如下步骤：将黄色短杆菌接入到含有生物素的发酵罐培养基中进行发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：按10-15%接种量将黄色短杆菌种子液接入装有发酵罐培养基的发酵罐中进行发酵培养；整个发酵过程中，通气量为1-2L/min，搅拌转速500-800r/min，通过自动流加氨水控制pH在7.0-7.2，培养温度33-36℃，以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为1-2g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵总时间为44h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：按10-15%接种量将黄色短杆菌种子液接入装有发酵罐培养基的发酵罐中进行发酵培养；整个发酵过程中，通气量为1-2 L/min，搅拌转速500-800r/min，通过自动流加氨水控制pH在7.0-7.2，培养温度33-36℃，以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持罐内糖浓度为1-2g/L；发酵至36h时，将发酵罐中的发酵液经由陶瓷膜分离得到滤液和浓缩菌体，将滤液排出，把浓缩菌体打回发酵罐，同时向发酵罐中补加发酵罐培养基，继续发酵20h，完成发酵。
L-精氨酸合成及高产菌选育与发酵研究进展
库 利 棒 杆 菌
Ａ Ｃ １ ８ ８ 及 黄 色 短 杆 菌 Ｔ Ｃ３ ６
Ａ Ｃ １０ ７中 ， 建 精 氨 酸 工 程 菌 。最 近 ，ｋｄ Ｔ Ｃ ４６ 构 Ｉｅａ 等¨ 以 ３株 谷 氨 酸棒 杆 菌 突变 株 为 出发 菌 株进 行基 因 重 组 ， 得 高 产 精 氨 酸 菌 株 。 表 明 将 获 Ａ ｒＲ和 ａｇ ２ ａｇ ｒＢ ６组 合 并 导 人 野 生 型 ｃ ｌｔｍ — ．ｇｕａ ｉ ｃｍ 中 ， ｕ 可得 到 精 氨 酸 高产 菌 株 。来 源 于亮 氨酸
（ 江 师 范大 学 化 学 与生 命 科 学 学 院 ， 江 金 华 浙 浙 ３ １０ ） ２ ０４
摘
要
精 氨 酸是 合 成蛋 白质 的重 要 原 料 ， 一 些代 谢 途 径 的 中间 代谢 物 。 它在 人 和 动 物 体 内具 有 重 要 的 生 是
理 生 化 功 能 ， 食 品 与 医药 工 业 应 用 十 分 广 泛 。对 精 氨 酸 高产 菌 株 选 育 、 酵 工 艺优 化 、 核 生 物 中的 合 成 途 在 发 真 径 、 谢 调 控 机 制 等 方 面 最 新 研 究进 展 做 了 综述 。 代 关 键词 精氨 酸； 成途径 ； 控机制 ； 合 调 菌种 选育 ； 酵 生产 发 Ｑ １ ８５ 文献标识码 Ａ 文章 编 号 １０ ７ ２ （ ０ ２ ０ —０７ ０ ０ ５— ０ １ ２ １ ） １ ０ ０— ５
鸟氨 酸 ， 甲酰磷 酸的合 成 ， 氨 鸟氨 酸与 氨 甲酰磷 酸
合 成精 氨酸 。精氨 酸合成途 径见 图 １ 。
２ １ 精 氨酸 的合成 ．
２ １ １ 鸟氨 酸的合 成 ． ．
在 ２种 模式 生物 中 ， 氨 鸟
生 产菌株 的基 因 ｌ Ｃ ５ ， ｅ ４ ６ 能够 提高 氨基酸包 括精 ｕ
L-色氨酸
L-色氨酸的生产及其代谢控制育种摘要本文综述了利用微生物生产L-色氨酸的各种方法和L-色氨酸的生物合成途径及其代谢调控机制，并介绍了利用重组DNA技术选育L-色氨酸高产菌的研究现状。
L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度1.l4g(25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。
微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
它是人体和动物生命活动中必需的氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等方面。
在生物体内，从-色氨酸出发可合成5-羟基色胺等激素以及色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，可预防和治疗糙皮病，同时具有消除精神紧张、改善睡眠效果等功效。
色氨酸代谢失凋会引起糖尿病和神经错乱，因此在医学上被用作氨基酸注射液和复合氨基酸制剂。
另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用它强化食品和做饲料添加剂对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作用，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。
1.色氨酸的生产方法色氨酸的生产最早主要依*化学合成法和蛋白质水解法，但是随着对微生物法生产色氨酸研究的不断深入，这种方法已经走向实用并且处于主导地位。
微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。
近年来还出现了将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸的研究。
另外，重组DNA技术在微生物育种和酶工业上的应用极大地推动了直接发酵法和酶法生产色氨酸的工业化进程。
1.1微生物转化法亦称前体发酵法。
这种方法使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。
这种方法同直接发酵法一样，需要解除生物合成途径中大部分酶所受到的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。
另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量添加的方法。
《氨基酸工艺学》3 氨基酸生产菌选育
顺乌头酸酶 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶 酮戊二酸脱氢酶 异柠檬酸裂解酶
谷氨酸，苏氨酸
途径 基因
酶
氨基酸
氮同 作用
化
gdhA gltAB
glnA
谷氨酸脱氢酶 谷氨酰胺酮戊二酸转氨酶 谷氨酸 谷氨酰胺合成酶
运输 gluABC 谷氨酸吸收 D
热力学 cytB unc
细胞色素B H+-ATP酶亚基
谷氨酸
3.1.3.2 大肠杆菌基因组研究进展
大肠杆菌MG1655基 因组计划起始于20世 纪90年代初，现在已 经公开发表 (GenBank No: NC_000913) 。
大肠杆菌基因组的染色体为环状，包含4639221个碱基对， GC含量为50.8%。
将基因操作技术用于大肠杆菌的研究始于20世纪70年代，至 今已有40年多的历史。
途径 基因
回 补 途 ppc
径
pyc
酶
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 丙酮酸羧化酶
氨基酸
谷氨酸，苏氨酸 赖氨酸
乙
CoA 谢
酰 代
pdhA dtsRl dtjR2
accBC
aco
TCA 循 环
gltA ifd
odhA
icl
丙酮酸脱氢酶 脂肪酸合成相关酶 dtsRl同源蛋白 乙酰CoA羧化酶亚基B、C
谷氨酸，赖氨酸
(7) 选育能提高谷氨酸通透性的菌株
选育生物素缺陷型菌株
选育油酸缺陷型菌株
选育甘油缺陷型菌株
选育温度敏感型菌株 选育细胞壁不完整的菌株
✓ 如：VP类衍生物抗性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、 乙酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增强谷氨 酸的通透性。
3.2.1.5 精氨酸产生菌的代谢控制育种策略
L-异亮氨酸产生菌黄色短杆菌的选育
收稿 日期 ：２ １ －０２ ０ Ｉ１—５ 作 者简介 ：沈加彬 ， １８ 在读硕士 ， 男（９ ５） 研究方向为微生物遗传育种 。 基金项 目： 福建省 自然科 学基金 项 目（ ｏ ９ｏ １ ８ ； 建省科 技重 ２ ｏＪ １ ２ ） 福
摘 要 ：以黄 色 短 杆 菌 Ｂ ４ ０为 出发 菌 株 ， 过 紫 外 线 和 亚 硝 基 胍 （ Ｇ） 合 诱 变 处 理 后 ， 得 一 株 甲硫 氨 酸缺 陷 （ ｔ Ｆ２ 经 ＮＴ 复 获 Ｍｅ一）
及 抗 ａ氨 基 丁酸 （— Ｂ 的 Ｌ异 亮 氨酸 产 生 菌 Ｂ ６０ 该 菌 株 在 未 进 行 优 化 的 发 酵 条 件 下 能 够 积 累 Ｉ异 亮 氨 酸 的 量 为 ７ １ 一 ａＡ ） 一 Ｍ２ １ ， 『 ．２ ｇＬ ・ ， 出发 菌 株 Ｂ ４ ０提 高 了 １ ２ ５ 。 比 Ｆ２ ２ ．
１ 材料 与方 法 １ １ 材 料 ．
１ １ １ 菌种 ： 色短 杆 菌 Ｂ ４ ０为 本 实 验 室 保 藏 ．． 黄 Ｆ２
菌种 。 １ １ ２培养基 ．．
有许 多生 理功 能 ， 已被 广 泛应 用 到 医 药 、 品 、 味 食 调
剂、 动物饲 料 以及化 妆 品的制 造 中 ， 以在 医学研究 尤 和 治疗 中受 到重视口 。 ］
关 键 词 ： 异 亮 氨 酸 ； 色 短 杆 菌 ； 合 诱 变 ； 种 黄 复 育
中 图分 类 号 ： ９ Ｑ ３ 文献标识码 ： Ａ 文章 编号 ： ０ ６８ ７ （ ０ １ ０ —０ ８ ０ １０ —３ ６ ２ １ ）４０ ３—４
L_异亮氨酸菌种选育及发酵条件优化(1)
21 1 L2异亮氨酸产生菌选育谱系 从野 生 型 谷 氨 酸 产 生 菌 栖 糖 蜜 棒 杆 菌
( Cory nebacteri um mel assecol a ) A TCC17965 为 出 发菌株 ,经硫酸二乙酯和60 Co 诱变处理 ,依次赋予 S Gr 、L eu2M Er 、L eu2 、A HVr 、Sucg 、Et hr 遗传标记 ,得 到一株 L2异亮氨酸产生菌 I3125 ,在适宜的条件下 摇瓶产酸平均为 14～15 g/ L . 选育过程见图 1. 21 2 发酵培养基优化
M Er + L eu2 + A HVr + Sucg + Et hr ) ,在培养基未经优化的情况下产 L2异亮氨酸 14～的影响 ,在优化的培养基和发酵条件下积累 L2异亮氨酸 191 2
g/ L ,最高时可达 211 3 g/ L .
完全培养基 、基本培养基和种子培养基均以 20 %的 NaO H 调至 p H 71 0 , 01 1 M Pa 下 灭菌 20 min ; 发酵培养基以 20 %的 NaO H 调 p H 至 71 0 , 01 07 M Pa 压力灭菌 10 min. 11 3 培养方法 11 31 1 种子培养 接一环生长良好的斜面种子于 装有 40 mL 种子培养基的 250 mL 三角瓶中 ,30 ℃ 于往复式摇床上培养 11 h , 85 r/ min ,振幅 90 mm. 11 31 2 发酵培养 接 1 mL 种子液于装有 15 mL 发酵培养基的 250 mL 三角瓶中 ,30 ℃于往复式摇 床上培养 72 h , 100 r/ min ,振幅 90 mm. 11 4 诱变筛选方法
要[11] . 为此作者考察了在发酵培养基中分别添加不 同氮源 (含氮量以硫酸铵 40 g/ L 的用量的含氮量来 计算其它氮源的添加量) 对 I3125 合成 L2Ile 影响 , 结果见图 3.
L亮氨酸
总结
大多数氨基酸均可通过以初生氨基酸为原料的 微生物转化作用而产生。
另外，有些氨基酸可以有机化合物和氨盐为前 体，在相应酶作用下而产生，如肉桂酸和氨在 苯丙氨酸解氨酶作用下，可生成L-苯丙氨酸； 吲哚和丝氨酸在色氨酸合成酶作用下转化成L色氨酸等。
发酵法中氨基酸的碳链主要来自糖代谢中间产 物，如草酰乙酸、α-酮戊二酸、赤藓糖-4-磷 酸、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸、3-磷酸甘油酸 及分枝酸等。
3.氨基酸精制方法：
分离出的特定氨基酸中常有少量其它杂质，需进行精制， 常用的有结晶和重结晶技术，也可采用溶解度法或结晶与 溶解度法相结合的技术。
如丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pH为6.0，故丙 氨酸可在pH6.0时，用50％冷乙醇结晶或重结晶加以精制。
此外也可用溶解度与结晶技术相结合的方法精制氨基酸。 如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若将含少量 酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍体积(W/V)的热水中，调 pH4.0左右，经脱色过滤可除去大部分酪氨酸；滤液浓缩至 原体积的1/3，加2倍体积(V/V)的95％乙醇，4℃放置，滤 取结晶，用95％乙醇洗涤，烘干即得苯丙氨酸精品。
二、L胱氨酸(L-Cystine)的制备
1．L-胱氨酸的结构与性质
L-胱氨酸存在于所有蛋白质分子中，尤以毛、 发及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由两分子半胱 氨酸脱氢氧化而成，含两个氨基、两个羧基及一个二 硫键，分子式为C6H12N204S2，分子量为240.29， 结构为：
2．工艺路线
L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶体， 在25℃水中溶解度为0.011，在75℃水中为0.052。 溶于无机酸及无机碱，在热碱液中可被分解。
（五）世界氨基酸产业现状
支链氨基酸合成调控机制及菌种选育策略研究进展
支链氨基酸合成调控机制及菌种选育策略研究进展前言支链氨基酸（BBCAs）包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，均为必需氨基酸，机体不能自身合成，只能通过食物补充。
它们不仅能调节蛋白质的代谢和机体免疫力，还能在机体运动中增加蛋白质的合成，降低肌肉蛋白的分解和损伤，是一类特别重要的营养补充剂，广泛运用于医药、食品及饲料生产等行业。
然而，目前国内生产厂家少，产酸水平低，远远不能满足市场的需求，仅配制氨基酸输液每年就需进口上百吨。
因此，了解支链氨基酸的生物合成及代谢调控机制，选育生产性能良好的高产菌株极为重要。
本文主要介绍了支链氨基酸的生物合成和代谢调节，以及高产菌株选育策略研究进展，为国内相关生产提供参考。
1. 支链氨基酸的生物合成途径1.1 生物合成方法：发酵法1.2 主要发酵菌株：谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum )黄色短杆菌(brevibacterium flavwn )乳糖发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum )大肠杆菌(escherichia coli )1.3 支链氨基酸生物合成途径注：图中虚线内表示三种支链氨基酸的合成途径，虚线内大写字母表示相应中间产物的缩写。
椭圆型内表示合成过程中相应的关键酶。
图1 支链氨基酸生物合成途径（1）乙酰羟酸合成酶（AHAS）（α-酮丁酸→α-乙酰-α-羟基丁酸）有三种同工酶。
分别由ilvBN，ilvGM，ilvIH编码。
ilvBN高效表达阻碍丙氨酸合成，提高支链氨基酸生成量。
有人证明通过将黄色短杆菌ilvBN 基因高效表达，是缬氨酸产量提高了9.85%，同时是丙氨酸和乙酸产量下降了30.49%和20.89%。
（2）二羟基脱水酶（DHAD）（α,β-二羟基-β-甲基戊酸→α-酮-β-甲基戊酸）在谷氨酸棒状杆菌中，该酶受到L-缬氨酸和L-亮氨酸抑制，不过在三种氨基酸都存在的情况下，没有发现协同抑制作用。
氨基酸类药物的生产方法
③粗制 升温至65～70℃，搅拌半小时，加活性炭16kg， 于80～90℃保温半小时，滤除活性炭。调滤液至 pH4.8，静置结晶，吸出上清液后，底部沉淀经离心 甩干得胱氨酸粗品（Ⅱ）。
④精制 中和 升温至70℃，加活性炭1.5～2.5kg，85℃ 搅 拌 半 小 时 ， 过 滤 ， 加 1.5 倍 体 积 蒸 馏 水 ， 升 温 至 75 ～ 80℃ ， 搅 拌 下 用 12 ％ 氨 水 （ 化 学 纯 ） 中 和 至 pH3.5～4.0，析出结晶，滤取胱氨酸结晶，蒸馏水洗 至无氯离子，真空干燥得L-胱氨酸成品。
胱氨酸和酪氨酸均难溶于水，但在热水中酪氨酸 溶解度较大，而胱氨酸溶解度变化不大，故可将混合 物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分开。
（2）特殊试剂沉淀法 系采用某些有机或无机试剂与 相应氨基酸形成不溶性衍生物的分离方法。
如邻二甲苯-4-磺酸能与亮氨酸形成不溶性盐沉淀， 后者与氨水反应又可获得游离亮氨酸；
1、 目前全世界天然氨基酸的年总产量在百万吨左 右，其中产量较大者有谷氨酸、蛋氨酸及赖氨酸，其 次为天门冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它们主要用 于医药、食品、饲料及化工行业中。
2、 目前构成天然蛋白质的20种氨基酸的生产方法 有天然蛋白质水解法、发酵法、酶转化法及化学合成 法等四种。
3、 氨基酸及其衍生物类药物已有百种之多，但主 要是以20种氨基酸为原料经酯化、酰化、取代及成盐 等化学方法或酶转化法生产。
一、水解法
（一）基本原理与过程
以毛发、血粉及废蚕丝等蛋白质为原料，通过酸、 碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各 种药用氨基酸的方法称为水解法。
目前用水解法生产的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨 酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸 及L-丝氨酸等。
L-异亮氨酸菌种选育及发酵条件优化
国 内外报 道 了很 多 以 黄 色短 杆 菌 、 乳糖 发 酵短 杆菌 等 为出 发 菌 株选 育 Ｌ异 亮 氨 酸 产 生 茵 的育 种 ， 实例 。 采用栖 糖 蜜棒 杆 菌 为 出发 菌株 选 育 Ｌ异亮 但 － 氨酸 产 生菌还 未 见 报 道ｎ． 者 根 据 代 谢 控制 发酵 ］作 原理 ， 以栖糖 蜜棒 杆 菌 ＡＴ Ｃ１９５为 出发菌 株 ， Ｃ ７６ 经
ｇ Ｌ・ 高时可 迭 ２ ． ／ ． ／ 最 １ ３ｇ Ｌ
关键词 ：Ｌ 异亮 氨酸 ； － 育种 ； 发酵 ； 糖 蜜棒 杆 菌 栖
中圈分类 号 ： ８ ５ Ｑ １ 文 献标识 码 ： Ａ
Ｂｒ ｅ ｉ ｇ ｏ Ｉｏ ｅ ｃｎ ｒ ｄ ｃ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ａ ｒ ｎ ａ ｉ ｎ Ｃｏ ｄ ｔ ｎ ｅ ｄ ｎ ｆＬ—ｓ ｌｕ ｉ ｅ Ｐ ｏ ｕ ｅ ｎ ｔ Ｏｐ ｉ ｌＦｅ ｍｅ ｔ ｔｏ ｎ ｉ ｏ ｓ ｓ ｍ ｉ
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L-苏氨酸高产菌的选育
L-苏氨酸高产菌的选育L-苏氨酸高产菌的选育引言L-苏氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域。
为了满足市场需求，高产菌的选育成为提高L-苏氨酸生产的关键。
本文将介绍L-苏氨酸高产菌的选育步骤、方法及应用前景。
一、菌种的筛选筛选过程通常包括资源获取、筛选条件的确定和菌种纯化。
1. 资源获取L-苏氨酸高产菌可从自然环境中获得，也可从已有菌种中获得。
通过分离特定环境样品中的微生物，筛选出能产生L-苏氨酸的潜在菌株。
2. 筛选条件的确定菌种筛选时需要确定合适的条件，如温度、pH值、营养成分等。
通常以L-苏氨酸产量作为评价指标，通过逐步调节不同条件，筛选出最佳产量的菌株。
3. 菌种纯化从活培养物中筛选出产量高的菌株后，需要进行纯化。
常用的方法包括传代培养、菌种生成菌落、孢子形成等，以获得纯净的菌株。
二、基因工程改良基因工程技术可通过改变菌株的遗传背景来提高L-苏氨酸的产量。
常用的基因工程改良方法有基因克隆、基因敲入和基因敲除等。
1. 基因克隆基因克隆是将目标基因从高产菌株中克隆出来，并在低产株中进行表达。
通过比较两者的产量差异，确定目标基因是否能够提高L-苏氨酸的产量。
2. 基因敲入基因敲入是将目标基因导入菌株中，使其在菌株中表达。
常用的方法有转基因技术和化学合成技术等。
这些方法使得菌株从无法产生L-苏氨酸到可以高产L-苏氨酸。
3. 基因敲除基因敲除是通过诱导菌株发生基因突变或通过CRISPR/Cas9技术来删除特定基因。
通过删除抑制L-苏氨酸生产的基因，可以提高菌株的产量。
三、应用前景L-苏氨酸广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域。
随着生物技术的不断发展，L-苏氨酸高产菌的选育对于满足市场需求具有重要意义。
1. 食品领域L-苏氨酸可作为增味剂广泛应用于各种食品中。
高产菌的选育可以提高生产效率，降低生产成本，为食品行业提供更加可靠的供应。
2. 饲料领域L-苏氨酸在动物饲料中可作为氨基酸添加剂，能够提高动物的饲料转化率和生长速度。
亮氨酸生产工艺
亮氨酸生产工艺亮氨酸（L-leucine）是人体内必需的氨基酸之一，也是一种重要的蛋白质成分。
现在，亮氨酸已经广泛应用于食品、保健品和医药等领域。
下面我将介绍一种亮氨酸的生产工艺。
首先，亮氨酸的生产主要通过微生物发酵的方式进行。
最常用的微生物是大肠杆菌、首乌曲霉和酿酒酵母等。
这些微生物经过经过基因工程改造，使其能够高效地合成亮氨酸。
工艺的第一步是菌种培养。
首先，将选定的微生物菌种接种到培养基中，然后进行发酵。
培养基通常包含碳源、氮源、无机盐和生长因子等物质。
发酵条件包括温度、湿度、pH值、通气速率和搅拌速率等参数的控制。
发酵时间一般持续24-48小时。
在发酵过程中，微生物会利用培养基中的碳源进行代谢，产生亮氨酸。
亮氨酸的合成由多个酶催化的反应组成，包括酶聚酰化、氨基酸合成和分裂、脱氢作用等。
为了提高产量，需要在发酵过程中合理控制这些反应的速率和平衡。
发酵结束后，需要对发酵液进行分离和纯化。
常用的分离方法有离心、滤液和沉淀等。
纯化主要通过各种色谱技术进行，如离子交换色谱和凝胶过滤色谱等。
这些技术能够去除发酵液中的杂质，提高亮氨酸的纯度。
最后，通过结晶、干燥和粉碎等步骤，得到成品亮氨酸。
总的来说，亮氨酸的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、分离和纯化等步骤。
不同的微生物菌株和发酵条件对亮氨酸的产量和纯度有着重要影响。
因此，需要通过优化发酵条件和改良菌株，提高亮氨酸的生产效率和质量。
目前，亮氨酸的生产工艺已经相对成熟，能够满足市场需求。
然而，随着人们对健康食品和保健品的需求增加，对亮氨酸的需求也会进一步增长。
因此，未来的发展方向主要是提高亮氨酸的产量和质量，并探索更加环保和经济的生产工艺。
亮氨酸的生产工艺是一个综合性的工程，需要涉及发酵、分离、纯化等多个领域的知识和技术。
通过不断的研究和创新，相信亮氨酸的生产工艺将会进一步完善，为人们的健康和生活带来更多益处。
亮氨酸在微生物限度检查方面的研究
亮氨酸在微生物限度检查方面的研究摘要：我公司现依据《中国药典》2015版收载的微生物限度检查法对亮氨酸进行微生物限度检查，进行实验以保证检测方式符合要求。
确保该方式在本实验室现有实验条件下具有良好的适用性、稳定性及准确性，能够确实有效的控制与保障产品质量。
关键词：检查方式的研究、控制与保障产品质量引言：根据要求，需对亮氨酸微生物限度检查方式进行研究。
研究内容包括需氧菌数量、霉菌和酵母菌数量和控制菌大肠埃希菌方法的研究。
按照亮氨酸的理化特性与生物学特性，制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行亮氨酸微生物限度检查；若不符合，应重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准，以确定适合的检查方法，提高效率的同时也要保障产品的质量。
1.仪器与材料：1.1仪器与材料试验用供试品：选取三批亮氨酸。
1.2验证用设备：表1：试验用设备及耗材一览表1.3试验用玻璃器具、仪器：验证中所用计量器具均须经计量部门的校验，合格后，才能使用。
1.4验证用培养基及缓冲液：验证中所用的培养基均须经过适用性试验，培养基和试液均须经过121℃灭菌15分钟，并且应保证在验证使用过程中都在灭菌的效期之内，如超出之后不再使用。
1.5试验用培养基及缓冲液：表2：试验用培养基及缓冲溶液一览表1.6试验用菌种：表3：验证菌种一览表铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为需氧菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株；大肠埃希菌为控制菌验证用菌株。
验证实验所用的菌株传代次数在5代以内（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），在保藏方式上采取适宜的方法，以保证试验菌株的生物学特性。
2.试验方法及结果2.1 供试液制备：2.1.1供试品：亮氨酸2.1.2稀释剂：pH7.0无菌氯化钠-卵白胨缓冲液2.1.3制备方法：称取供试品10g，置于250mL锥形瓶中，加入稀释剂至100mL，混匀, 制作1:10的供试液。
13_异亮氨酸
第十三章异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵第一节分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见表13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branched chain amino acids）。
分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。
但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。
目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。
表13-1 分枝链氨基酸的结构名称结构式分子式分子量异亮氨酸（Ile）C6H13O2N 131.18亮氨酸（Leu）C6H13O2N 131.18缬氨酸（Val）C5H11O2N 117.15Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。
很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。
Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。
要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。
然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。
直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。
表13-2 Ile的四种光学异构体L-Ile D-Ile D-别Ile L-别Ile 1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。
出于V aI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，V al及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。
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成 途径 、 代谢 调节机 制 ； 阐述 了采 用代谢控 制手段 如何选 育 Ｌ一亮氨酸 高产 茵的育种 战略 。 关键 词 ： Ｌ一亮氨 酸 ； 代谢 调 节机 制 ； 育种
Ｔｈ ｔ ｄ ｎ Ｌ —Ｌｅ ｃｎ ｎ ｔ ｔ ａｎ Ｉ ｒ ｖ ｍ ｅ ｔ ｅ Ｓ ｕ ｙ ｏ — ｕ ｉ ｅ ａ ｄ ｉ Ｓ ｒ ｉ ｍｐ ｏ ｅ ｎ ｓ
晶或结晶性粉末 ， 微苦 ， 不溶于氯仿和甲醇 ， 乙醇 中微 溶 ； 为非 极性 。亮 氨 酸在 ｌＯ Ｌ水 中 ２ 。 Ｏｍ ０ｃ 时溶 解 度 为 ２ ３ｇ 可 从 水 中 结 晶 ； 旋 光 度 ．７ ， 比 ［ Ｄ 为 ＋ ４ ５一＋１． 。当纸层析的展开剂 ］∞ １． ６０ 分 别 为 ｎ一丁醇 一乙醇 一水 （ ：： ） 苯 酚 一水 ４２１ ，
Ａｂｓｒ ｃ ：Ｔｈ ａ ｅ ｅ ｃ ｉｅ ｈ ｔｕ ｔｒ ｐ ｏ ｒｉｓ， ｓ ｇ ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｍｅｈｏ ｎ ｂ ｅ ， ｔａ ｔ ｅ ｐ ｐ ｒｄ ｓ ｒｂ ｄ ｔｅ ｓｒ ｃｕ ｅ， ｒｐｅｔｅ ｕ ａ ｅ， ｒ ｄ ｃ ｎ ｔ ｄｓｉ ｒ ｆ ｉ ａ ｄ ｄ ｓ ｕ ｓ ｄ ｔ ｅ ｂ ｏ ｙ ｔ ｅ ｉ ａ ｗａ ｄ ｍｅａ ｏｉ ｅ ｕ ａ ｉｎ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ｎ ｉｃ ｓ ｅ ｉｓ ｎ ｓｓ ｐ ｔ ｙ ａ ｔｂ ｌ ｒ ｇ ｌｔｏ ｃ ａ ｉｍ． Ｔｈ ｕ ｏ ｉ ｌ ｈ ｈ ｈ ｎ ｃ ｅ ａ ｔ ｒ ｍａｎ ｙ ｈ
（ ：） ５ １ 和二 甲基 吡啶 一 甲基 吡啶 一水 （ ２ ２ 三 ２：： ）
养成分 的高低 主要看这八种氨基酸 的含量和种 类， 营养学 中的完全蛋 白， 亮氨酸所 占份额 Ｌ一
最高 ， 以说 Ｌ一亮氨 酸是 一种 非常重 要 的氨基 所
酸。
时， 亮氨酸的 Ｒ 值分别为 ０６ （ Ｌ一 ．９ 红色斑点） ，
缬 氨酸 ， 苏氨 酸 ， 丙 氨酸 ， 氨酸 ， 氨酸 和 色 苯 蛋 赖 氨酸 。从 营养 学 的角度 来讲 ， 价一种 蛋 白质营 评
（ Ｈ ）Ｃ Ｈ Ｃ Ｎ ２ Ｃ Ｏ Ｃ ３ ２ ＨＣ ２ Ｈ（ Ｈ ） Ｏ Ｈ。
Ｌ一 亮氨酸的相对分子质量为 １ １１ ， ３ ．８ 含碳
５ ．９ ； １ ．７ ； ４８ ％ 氮 ０ ６ ％ 溶点 ２３Ｃ， 品为 白色结 ９。 纯
一
２ 一 ６
中国饲料添加剂
２０ ０７年第 ９期 （ 总第 ６ ） ３期
Ｌ一亮氨酸 的初步研究及菌种选育
王 文风 徐 玲 王 瑞明
（ 山东轻工业学院食品与生物工程学院， 山东 济南 ２０５ ） ５３３
摘
要： 简述 了 Ｌ一亮氨 酸 的结构 、 性质 、 用途和 生产 方 法 ， 讨论 了 Ｌ一亮氨酸 的 生物合
Ｗ ａ ｅ ｆ ｎ Ｘｕ Ｌｉ Ｗ ａ ｉ ｉ ｇ ｎｇ Ｗ ｎ ｅ ｇ ｎｇ ｎｇ Ｒｕｍ ｎ
（ ｅ ａ ｍｅ ｔ ｆ ｏｄ ａ ｄ Ｂｏ ｇ ｎ ｉｅ ｒ ｇ Ｓ ａ ｄ ｎ ｓ ｔ ｅｏ ｉ ｔ ｄ ｓ ， ｉａ ５ ３ ３ Ｄ ｐ ｒ ｎ ｏ ｏ ｎ ｉ ｏ ｙＥ ｇ ｅ ｎ ， ｈ ｏ ｇＩ ｔｕ ｆ ｇ ｌ ｕ ｔ Ｊ ｎ ２ ０ ５ ） ｔ Ｆ ｌ ｎ ｉ ｎ ｎｉ ｔ Ｌ ｈ ｎ ｙ ｎ
氨基酸是构成蛋白质的基本单位 ， 在生物体 内具有 特殊 的生理 功能 ， 参与细 胞 中多 种化合 物 的合成代谢 ， 是生物体 内不可缺少 的营养成分。 自然界存在的氨基酸有一百多种 ， 构成人体蛋 白 质 的氨 基 酸 只有 ２ Ｏ种 。其 中有 八 种 必 需 氨基 酸， 亮氨酸是其 中之一， Ｌ一 其他还有异亮氨酸，
１１ Ｌ一 氨酸 的用 途 ． 亮
Ｌ一 氨酸 与 Ｌ一异亮 氨酸 （ 亮 Ｌ—ｉ ｌ ｃ ｅ ｖｌ ｅ 的分 子 结 构 中 含有 一个 ａｎ ） ｉ 甲基 侧 链 而被 称 为 支链 氨基 酸 （ ｒｎｈｄｃａｎ Ｂａｃｅ ｈｉ ａ ｉｏａｉｓＢ Ａ 。Ｌ一亮 氨 酸 是人 与 动 物 自 ｍｎ ｃ ，Ｃ Ａ） ｄ 身不 能合成 而必须 依 赖 外 源供 给 的八 大 必 需 氨
ｍｅ ｎｓｏ ｔ ｂ ｌｃ ｃ ｎ ｒ １ ａ ｆｍｅａ ｏ ｉ ｏ ｔｏ ．
Ｋｅ ｏ ｄ ： —ｌ ｕ ｉ ｅ ｍｅａ ｏｉ ｅ ｌ ｔ ｎ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ； ｒｅ ｉ ｇ ｙ Ｗ ｒ ｓ Ｌ ｅ ｃｎ ； ｔｂ ｌ ｒ ｇ ａｉ ｃ ａ ｉｍ ｂ ｅ ｄ ｎ ｃ ｕ ｏ
结晶， 并定名为亮氨酸…。Ｌ一 亮氨酸的化学名
称为 ： Ｌ一２一氨基 一 ４一甲基戊 酸或 ｄ一氨基 异
己 酸 ， 子 式 为 ：ｃＨ，Ｎ ： 分 Ｏ ，结 构 式 为：
王文风 ， Ｌ一亮氨酸的初步研究及菌种选育 等：
一 ２ 一 ７
基酸 之一 ， 临床选用 的复合结 晶氨基 酸静脉 注 是 射液 不可 缺 少 的原 料 。Ｌ一亮 氨 酸 对 维 持 危重 病人 的营 养需 要 ， 救 患者 生命 起 着积 极 作用 。 抢 亮氨 酸还 在调 节 氨基 酸 与 蛋 白质 代 谢 方 面起重
０８ （ 色斑点 ）０６ （ 色斑点 ） ．４ 红 ，．２ 紫 。
１ Ｌ一亮氨酸 的用途及 生产方 法
Ｌ一亮氨 酸 （ Ｌ—ｌ ｃ ｅ 又 称 白氨 酸 ， 在 ｅ ｉ ） ｕｎ 是 １１ 经 Ｐ ｕｔ ８９年 ｏ ｒ ｓ 首先 从 奶 酪 中分 离 出来 的 ， 以 后 Ｂａｏｎｔ 肌 肉与羊 毛 的酸 水解物 中得 到其 ｒｃｎｏ从
ｅ ｐ ｕ ｄ ｄ ｔ ｅ ｂ ｅ ｄ ｎ ｔ ｔｇｅ ｂ ｕ ｏ ｏ ｏ ｔｉ — ｌｕ ｉ ｅ ｈ ｇ — ｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｓｒ ｉ ｓ ｂ ｘ ｏ ｎ ｅ ｒ ｅ ｉ ｇ ｓ ａｅ ｉ ｓ ａ ｏ ｔ ｈ ｗ ｔ ｂ ａｎ Ｌ — ｅ ｃｎ ｉ ｈ － ｒｄ ｃｎ ｔ ｎ ｙ ｈ ｒ ａ