川贝母 检验标准操作规程

川贝母检验标准操作规程目的：建立川贝母检验标准操作规程。

规范检验操作，确保川贝母质量。

适用范围：适用于川贝母的检验。

责任者：质量管理部经理、质检中心主任、质量检验员。

内容：1品名：川贝母2取样：按药材和饮片取样标准操作规程（SOP-QC-ZJ-6065）取样3检验依据：川贝母内控质量标准（STP-QS-ZJ-3015）4性状松贝取本品，置明亮处用肉眼观察，呈类圆锥形或近球型,尺量，高0.3~0.8cm，直径0.3~0.9cm。

，表面类白色。

外层鳞叶2瓣，大小悬殊，大瓣紧抱小瓣，未抱部分呈新月形，习称“怀中抱月”；顶部闭合，内有类圆形，顶端稍尖的心芽和小鳞叶1~2枚；先端钝圆或稍尖，微凹入，中心有1灰褐色的鳞茎盘，偶有残存须根。

质硬而脆，断面白色，富粉性。

气微，味微苦。

青贝呈类扁球形，高0.4~1.4cm，直径0.4~1.6cm。

外层鳞叶2瓣，大小相近，相对抱合，顶部开裂，内有心芽和小鳞叶2~3枚及细圆柱形的残茎。

炉贝呈长圆形，高0.7~2.5cm，直径0.5~2.5cm。

表面类白色或浅棕黄色，有的具棕色斑点。

外层鳞叶2瓣，大小相近，顶部开裂而略尖，基部稍尖或较钝。

5鉴别：5.1仪器：显微镜、超声波清洗机、电子恒温水浴锅、薄层喷雾气压泵、电子天平5.2试剂与试液5.2.1试剂：二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、浓氨试液5.2.2试液水合氯醛试液：取水合氯醛50g，加水15ml与甘油10ml使溶解，即得。

甘油乙醇试液：取甘油、稀乙醇各1份，混合，即得。

碘化钾溶液：取碘化钾16.5g，加水使溶解成100ml，即得。

临用新制。

稀碘化铋钾试液：取次硝酸铋0.85g，加冰醋酸10ml与水40ml溶解后，即得。

临用前取5ml，加碘化钾溶液（4→10）5ml，再加冰醋酸20ml，加水稀释至100ml，即得。

亚硝酸钠乙醇试液：取亚硝酸钠1g，加乙醇使溶解成100ml，即得。

5.3对照品与：贝母辛对照品、贝母素乙对照品5.4操作方法5.4.1按显微鉴别法标准操作规程（SOP-QC-ZJ-6034）检查。

松贝、青贝、取本品粉末10g，过四号筛，平铺于洁净的白纸上，在明亮处用肉眼观察，本品粉末类白色。

挑取少许置载玻片上，滴加水合氯醛试液2滴，将载玻片置酒精灯火焰上方2cm处往返摆动加热至边缘起小泡，即停止加热，补充试液后再加热，直至透化完全。

透化后放冷，加甘油乙醇2滴，盖上盖玻片。

置显微镜下观察，淀粉粒甚多，广卵形、长圆形或不规则圆形，有的边缘不平整或略作分枝状，直径5~64µm，脐点短缝状、点状、人字状或马蹄状，层纹隐约可见。

表皮细胞类长方形，垂周壁微波状弯曲，偶见不定式气孔，圆形或扁圆形。

螺纹导管直径5～26µm。

炉贝取本品粉末10g，过四号筛，平铺于洁净的白纸上，在明亮处用肉眼观察，本品粉末类白色。

挑取少许置载玻片上，滴加水合氯醛试液2滴，将载玻片置酒精灯火焰上方2cm处往返摆动加热至边缘起小泡，即停止加热，补充试液后再加热，直至透化完全。

透化后放冷，加甘油乙醇2滴，盖上盖玻片。

置显微镜下观察，淀粉粒广卵形、贝壳形、肾形或椭圆形，直径约至60µm，脐点人字状，星状或点状，层纹明显。

5.4.2 取本品粉末10g，置具塞小锥形瓶中加浓氨试液10ml，密塞，浸泡1小时，加二氯甲烷40ml，超声处理1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇O.5mI使溶解，作为供试品溶液。

另取贝母素乙对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液.作为对照品溶液。

按薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取供斌品溶液1～6μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液-水(18：2：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，依次喷以稀碘化铋钾试液和亚硝酸钠乙醇试液。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

5.4.3聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性方法。

模板DNA提取取本品0.1 g，依次用75 %乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。

取20mg，置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA：〔加入缓冲液AP1 400 µL和RNA酶溶液（10 mg/ml）4µL，涡旋振荡，65 ℃水浴加热10分钟，加入缓冲液AP2 130µL，充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转速为每分钟14000转）10分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700 µL，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500 µL，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再离心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50µL洗脱缓冲液，室温放置3～5分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟，将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟〕，取洗脱液，作为供试品溶液，置4 ℃冰箱中备用。

另取川贝母对照药材0.1 g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

PCR-RFLP反应鉴别引物：5'CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT3'。

PCR反应体系：在200 µL 离心管中进行，反应总体积为30 µL，反应体系包括10 × PCR缓冲液3 µL，二氯化镁（25 mmol/L）2.4 µL，dNTP（10 mmol/L）0.6 µL，鉴别引物（30 µmol/L）各0.5 µL，高保真Taq DAN聚合酶（5 U/µL）0.2µL，模板1µL，无菌超纯水21.8 µL。

将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性4分钟，循环反应30次（95 ℃30秒，55~58℃ 30秒，72℃ 30秒），72 ℃延伸5分钟。

取PCR反应液，置500 µL离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20 µL，反应体系包括10 ×酶切缓冲液2 µL，PCR反应液6 µL，Sma I（10 U/µL）0.5 µL，无菌超纯水11.5 µL，酶切反应在30 ℃水浴反应2小时。

另取无菌超纯水，同法上述PCR-RFLP反应操作，作为空白对照。

电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为 1.5 %，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRad，供试品与对照药材酶切反应液的上样量分别为8µLDNA，DNA分子标记上样量为1 µL（0.5µg/µL）。

电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上或紫外透射仪上检视。

供试品凝胶电泳图谱中，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250 bp应有两条DNA条带，空白对照无条带。

6检查6.1水分：按水分测定法标准操作规程（SOP-QC-ZJ-6020）烘干法测定，不得过15.0%。

6.1.1仪器：鼓风电热恒温干燥箱、电子天平。

6.1.2操作方法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30分钟。

取洁净的称量瓶，置烘箱内100～105℃干燥2小时，取出，置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，再置烘箱内100～105℃干燥1小时，取出置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。

取供试品最粗粉2～5g ，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm 。

精密称定，记录数据，打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时 ，冷却，称重，并记录数据，至连续两次称重的差异不超过5mg 为止。

根据减失的重量，计算出供试品中含水量(%)。

%100--%⨯+++=称量瓶称量瓶）（干燥前样品称量瓶）（干燥后样品称量瓶）（干燥前样品水分 6.2总灰分：按灰分测定法标准操作规程（SOP-QC-ZJ-6016)总灰分测定法测定，不得过5.0%。

6.2.1仪器：节能电阻炉、电子天平、坩锅。

6.2.2操作方法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30分钟。

取洁净的坩埚，置节能电阻炉内，将坩埚盖斜盖于坩埚上，经加热至600℃炽灼约1小时，停止加热，待节能电阻炉温度冷却至约300℃，取出坩埚，置干燥器内，盖好坩埚盖，放冷至室温，精密称定重量，再以同样条件重复操作，直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。

取能通过二号筛并混合均匀的粉末2～3g ，置炽灼至恒重的坩埚中，在电子天平上精密称定，放入节能电阻炉内，缓缓炽热，至完全炭化呈黑色，逐渐升高温度至500～600℃，停止加热，待节能电阻炉温度冷却至约300℃，取出观察 ，直至完全灰化，取出坩埚，置干燥器内，盖好坩埚盖，放冷至室温，精密称定重量，再以同样条件重复操作，直至连续两次炽灼后称重的差异在0.3mg 以下为止。

并记录数据。

根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量。

%100--%⨯++=空坩埚坩埚）（样品空坩埚坩埚）（灰分总灰分 6.3浸出物：按浸出物测定法标准操作规程（SOP-QC-ZJ-6015）项下的热浸法测定，用稀乙醇作溶剂，不得少于9.0%。

6.3.1仪器：鼓风电热恒温干燥箱、 电子天平、电子恒温水浴锅。

6.3.2试剂：稀乙醇：取乙醇53ml ，加水制成100ml 即得。

6.3.3操作方法：接通电子天平电源，启动电子天平，使电子天平预热30分钟。

取洁净的蒸发皿，置烘箱内100～105℃干燥1小时，取出，置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，再置烘箱内100～105℃干燥1小时，取出置干燥器中室温放置30分钟，精密称定重量，直至连续两次干燥后称重的差异在0.3mg 以下为止。

取能通过二号筛并混合均匀的供试品约4g ，置250ml 的锥形瓶中，精密加稀乙醇100ml ，密塞，称定重量，静置1小时后连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。

放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25ml ，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于100～105℃干燥3小时 ，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量。

并记录数据。

除另有规定外，以干燥品计算供试品浸出物的含量。

%10025%1100])[%⨯⨯-⨯⨯-+=）水分（供试品重量蒸发皿蒸发皿（浸出物浸出物 6.4二氧化硫残留量：按二氧化硫残留量测定法标准操作规程（SOP-QC-ZJ-6062）测定，不得过150mg/kg 。