抗体偶联药物中的生物分析

抗体偶联药物研发中的生物分析

李秀立, 陈笑艳, 钟大放*

(中国科学院上海药物研究所, 上海药物代谢研究中心, 上海201203)

摘要: 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂共价偶联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 可以提高抗肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用。ADCs结构具有异质性并且其药物−抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在体内呈动态变化, 其生物分析面临着巨大的挑战, 常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应(ELISA)和液相色谱−质谱分析(LC-MS)。ADCs同其他生物制品一样, 在体内可能会产生抗药抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), 影响其药效、药动学及安全性, 因此有必要评价其免疫原性。本文综述了在ADC研发过程中常见的基于ELISA和LC-MS方法的待测物分析, 包括DAR分布、总抗体、结合型抗体、结合型药物、游离药物以及ATA分析, 可为我国的ADCs研发提供参考。

关键词: 抗体偶联药物; 药物−抗体比值; 免疫原性; 酶联免疫吸附反应; 液相色谱−串联质谱

中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2016) 04-0517-12

Bioanalysis in the development of antibody-drug conjugates

LI Xiu-li, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang*

(Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai Institute of Materia Medica,

Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China)

Abstract: Antibody-drug conjugates (ADCs) are complex molecules with cytotoxic small molecular drugs covalently bound to monoclonal antibodies via a linker and can improve the targeted drug delivery with minimizing the systemic toxicity. ADCs are heterogeneous mixtures with different drug-to-antibody ratios (DARs) and the DAR distribution is dynamically changing in vivo, therefore the bioanalysis of the ADCs is challenging. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and LC-MS have been widely used in the ADCs bioanalytical assays. Just like other biotherapeutics, ADCs may elicit the host immune response and produce the anti-therapeutic antibody (ATA), which could affect its efficacy, pharmacokinetics, and safety. It is thereby important to investigate its immunogenicity in the ADC development. In this review, we summarized the ELISA- and LC-MS-based bioanalysis strategies for the development of ADCs, including DAR distribution, the determination of total antibody, conjugated antibody, conjugated drug, free drug, and ATA, with the expectation of providing insights and reference for the ADC development in China.

Key words: antibody-drug conjugate; drug-to-antibody ratio; immunogenicity; enzyme-linked immunosorbent assay; LC-MS

抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂(linker) 共价偶

收稿日期: 2015-09-08; 修回日期: 2015-10-11.

*通讯作者 Tel / Fax: 86-21-50800738, E-mail: dfzhong@ DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0792联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 用于治疗恶性肿瘤。单克隆抗体可以靶向结合肿瘤细胞表面的抗原, 通过细胞内化作用进入细胞。进入细胞后, 其结构中的小分子药物在溶酶体低pH环境或蛋白酶作用下释放出来, 发挥细胞毒作用。由于单克隆抗体的靶向性, 正常组织细胞内药物浓度较低。因此与传统

的抗肿瘤药物相比, ADC的系统毒性减少[1−3]。

ADC由于自身的优势, 逐渐成为工业界新药研发的热点。目前已经有3个ADC上市: Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, 2000年上市, 由于安全性问题2010年主动撤市)[4]、Adcetris (brentuximab vedotin, 2011年上市)[5]和Kadcyla (trastuzumab emtansine, T-DM1, 2013年上市)。Immunomedics公司的sacituzumab govitecan (IMMU-132) 在2015年进入FDA快速审评通道。截止2013年, 已有30多个ADC处于临床试验, 涉及20多个靶点, 分别针对血液肿瘤和实体瘤[6−8]。目前国内多家制药企业, 如山东齐鲁制药、江苏恒瑞、浙江海正和正大天晴等公司纷纷开展ADC的研究; Li等[9]也合成了多种新型高活性抗CD20抗体偶联药物, 其中2F2抗体的突变体定点偶联MMAE (monomethyl-auristatin E) 而成的ADC体内外抗肿瘤活性提高。

在药物研发过程中, 生物分析对于药动学(PK) 测定、PK/PD关系和安全性评价具有重要意义。随着ADC的研发热潮, ADC生物分析面临的挑战也凸显出来。本文首先概括了ADC生物分析需要考虑的因素, 并总结了基于酶联免疫吸附反应(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 和LC-MS方法的ADC 相关物质的生物分析。

1 ADC生物分析的考虑因素

1.1 ADC的异质性

ADC中抗体与小分子药物通过一段连接臂共价链接, 小分子药物可以通过该连接臂与抗体中的赖氨酸侧链氨基结合, 如T-DM1[10]; 或者与抗体链间的二硫键还原后得到的巯基结合, 如抗CD30的IgG1单克隆抗体cAC10-MMAE偶联物[11,12]; 或者与抗体上特定位点引入的工程化半胱氨酸残基结合, 如THIOMAB-药物偶联物[13,14]。通过前两种形式得到的ADC中小分子药物数目以及连接位置可能会不一致[15], ADC实际为混合物。有文献报道T-DM1的药物与抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在0～8之间, 平均DAR值为3.5[16], 通过链间二硫键还原得到的ADC DAR值通常为偶数[17]。通过抗体特定位点引入工程化半胱氨酸而得到的ADC异质性较低, 如有文献[14]报道可以获得DAR值为2的同源ADC。

1.2 DAR值体内动态变化

ADC中连接臂的化学稳定性、连接位置和溶剂可接触性(solvent accessibility) 等因素均会影响ADC 的稳定性[18]。尽管连接臂在设计时考虑到与靶标结合之前的pH值和蛋白酶等因素, 理论上ADC在血浆中是稳定的, 但是连接臂仍可能会在某些特殊情况下断裂, 小分子药物解离。例如, 以腙为基础的连接臂在血液中性(pH 7.3～7.5) 环境下稳定, 在溶酶体酶或低pH环境中小分子化合物可能会解离[19]; 通过二硫键或者半胱氨酸形成的ADC可能会对内源性含游离巯基的肽类或蛋白比较敏感, 如谷胱甘肽和白蛋白等, 连接臂−小分子药物会转移至谷胱甘肽或白蛋白结构中[18, 20]。小分子药物的解离会改变ADC的DAR值比例或出现新的DAR值ADC, 如抗体链间二硫键还原后得到的ADC在体内可能会出现奇数DAR 值[17, 21]。huC242-DM1 (即Cantuzumab mertansine) 实验中观察到结合型ADC比未结合的抗体清除快, 推测与药物的解离有关系[22], 有文献[23]表明ADC的清除率随DAR值增加而加快; T-DM1的体内研究表明随着时间的推移, T-DM1的平均DAR值逐渐降低[21]。尽管工程化的ADC异质性较低, 但是它在体内也可能会部分解离, 形成异质的混合物。小分子药物的解离和不同DAR值ADC清除率的不同, 造成ADC在体内动态变化。

1.3待测物的选择

对于小分子药物和蛋白类药物, 一般测定原形药物即可了解其暴露量与药效应答(exposure- response, ER) 的关系。但是ADC中同时具有抗体和小分子药物部分, 体内DAR值动态变化, 再加上目前ADC临床数据有限, 难以判断哪一种待测物决定或影响了ADC的ER关系。一般来说, 在ADC研发初期, 尽可能测定多种待测物以了解ADC中各个组成部分的PK特征。这些待测物一般包括: 总抗体(DAR≥0, 包括结合型抗体和游离的抗体)、结合型ADC (结合型抗体和结合型药物) 和游离小分子药物[21, 24]。总抗体的测定可以用于考察其PK特征是否符合一般的抗体PK特征, 不会因为药物结合而发生改变[21]。结合型抗体可以从两个角度进行考察: 测定结合型的抗体或药物, 后者可以提供抗体载药量的直接信息, 结合后者与总抗体的数据, 可以大致评估ADC平均DAR值的变化[21]。游离小分子药物的浓度被认为与其毒性相关, 如果游离小分子药物广泛分布在血浆中, 可能发生脱靶作用, 产生毒性[24]。上述待测物的信息综合起来有助于了解ADC的ER关系。除上述待测物外, DAR值的测定还可以提供ADC体内变化的信息, 有助于选择合适的分析技术[21]。此外, ADC作为生物大分子进入体内后, 可能会引起免疫原性, 产生抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), A TA 可能会导致ADC清除加快或药效降低, 或者ADC被