超级高效感受态细胞
高效感受态细胞制备试剂盒
高效感受态细胞制备试剂盒产品编号：SK9305/SK9306包装规格：40支/200支试剂盒组成组分 SK9305，40支 SK9306，200支BT Buffer F 10 ml 5 × 10 mlBT Buffer E 4 ml 5 × 4 ml2个 10个BT Media(1 Capsules for 50 mL)操作手册1份1份保存方法及注意事项BT Media以胶囊的形式提供，请于室温密封干燥保存。
BT Buffer F和BT Buffer E可于常温运输，收到后请于4°C保存，长期保存请置-20°C。
产品介绍生工BT高效感受态制备试剂盒采用了一种简单而可靠的方法制备感受态细胞，由该试剂盒制备的感受态细胞在进行转化时无需经过热激步骤，对于Ampicillin抗性质粒而言，甚至连活化步骤都可以省略，感受态细胞和DNA混合后即可直接涂布，极大地简化了转化过程，提高了实验效率。
用该试剂盒制备的大肠杆菌DH5α细胞使用pUC19质粒DNA转化，转化率可以达到107~109 cfu/µg DNA，对其他常用的工程菌株和质粒也同样适用。
产品特色1. 感受态制备流程快速简单。
2. 转化过程无需热激。
3. 转化效率高达107~109 cfu/µg DNA。
4. 使用感受态专用培养基，最大化感受态效率。
5. 适合大量制备。
高效感受态细胞制备流程自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、50 ml离心管、冰等。
BT Media培养基准备：将一只胶囊投入50 mL蒸馏水中，高压灭菌即可。
准备工作：将BT Buffer F和BT Buffer E放冰上预冷，预冷低温离心机至4°C。
1. 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线培养，置37°C培养箱中静置培养12~16 h待菌落生长至直径1~2 mm大小。
2. 挑取一个生长正常的菌落，接种至10~15 mL液体LB培养基中，于37°C摇床充分振荡（≥ 250 rpm）培养12~16 h。
超级感受态细胞制备
50mL甘油＋50mL去离子水。
配制50mL感受态细胞溶液
超级感受L PIPES配制100mL
计算： PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）分子量：335.37 a／335.37=0.1L x 0.1mol/L a＝3.35g 称取3.35g PIPES ，用去离子水定容至100mL **PIPES不好溶解，加NaOH调pH值至6.7？……本实验室PIPES可以直接溶解。 **PIPES不能高压，只能过滤（0.22uM滤器），配制好放4 ℃，用时吸取即可。 试剂二： 1.2mol/L氯化钙100mL
感受态细胞溶液
试剂
剂量量(mL) 剂量量(mL)
1.2mol/L CaCl2
0.1mol/L PIPES
2.5
5
5
10
50% glycerol
15
30
dd H2O
27.5
55
Total
50
100
配制好后冰上冷却
准备菌种： 1、取菌种划线无抗性固体LB平板，37℃温箱中培养过夜。 2、次日挑菌，无抗性液体LB小试管少量摇菌12小时（过夜）。 3、次日三角瓶100mL液体LB大量摇菌，接菌比例1:100. 4、摇菌至OD600在0.4-0.6。（此时可以准备冰盒，将感受态细胞液冰上预冷，同时超静台内冰盒上摆好1.5mL离 心管）。 5、将菌液于超静台内分装到4个50mL离心管，4℃条件下2500g离心5min，离心后弃尽上清。 6、每2个50mL离心管沉淀用20mL感受态细胞液重悬并合并成1管，再次4℃条件下2500g离心5min，离心后弃尽 上清。 7、再次用20mL感受态细胞液重悬，冰上作用30分钟（此时冰上摆管），4℃条件下2500g离心5min，离心后弃 尽上清。 8、每个离心管用10mL感受态细胞溶液悬起后，分装于标记好的1.5mL离心管，于-70℃保存。
TransEasy TM 超高效感受态细胞制备试剂 说明书
使用说明书TransEasy TM超高效感受态细胞制备试剂盒产品套装编号：U0201A / U0201B / U0201C产品成分包装规格储存条件Solution A1×1ml-20ºC保存。
1×10ml1×50mlSolution B1×1ml-20ºC保存。
1×10ml1×50mlpUC19(10 pg/μl) 1×50μl-20ºC保存。
产品概述本试剂盒是在制备高效感受态细胞的标准方法上结合了一步法制备感受态细胞的方法，既可以一步制备超高效的感受态细胞，又可把常态细胞（包括新鲜培养的菌液,新鲜的或4ºC放置数月的培养基菌落,甘油菌种保存液等）快速制备成感受态细胞。
产品特点一步超高效感受态细胞制备方法快速感受态细胞制备方法(细胞转化液)1. 转化率高：所制备的感受态细胞转化率可达109cfu/µgpUC19 DNA（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。
2. 操作简单：只需离心一次即可完成感受态细胞的制备。
3. 产率高：制备的感受态细胞数量比普通方法多一倍。
4. 稳定性好：所制细胞在-80ºC保存一年以上，其转化率几乎不会降低。
1. 转化率适中：使用10ng质粒转化一般能得到上万个转化子，效率在105到107cfu/μg质粒之间。
2. 操作简单快捷：不需专门制备感受态细胞，可直接使用常态细胞进行质粒转化，随用随配，整个操作过程在一个1.5ml离心管中即可完成。
3. 设备要求低：无需冷冻离心机和恒温摇床，菌种无需过夜培养，最短只需1小时培养时间。
用户需准备的试剂（相关配置见附录）S.O.B培养基（含有20mM Mg2+）液氮或者乙醇干冰S.O.C培养基LB平板（含有抗生素）用户需准备的设备温控摇床离心机（大量制备需冷冻离心机）超净工作台水浴锅分光光度计（可见光）感受态细胞制备操作流程方法一：一步超高效感受态制备方法1.接种从-80ºC冰箱中取出冻存的甘油菌，直接挑取部分菌液（无需解冻）接种于含100ml S.O.B培养基（含相应抗生素）的500ml三角瓶中，也可挑取已经划线纯化的新鲜单菌落接种于S.O.B培养基中，或者将已隔夜摇好的母液按照1:100比例接种于S.O.B培养基中，以上三种接种方法可以根据需要自主选择（直接从冻存的细菌原种接种培养的细菌，所得到的转化效率高于使用连续传代、4ºC或室温贮存的培养物）。
感受态细胞制备
感受态细胞制备
感受态细胞制备是一种技术，用于制备仅有一种特定细胞类型的
细胞株。
常用于生物医学研究中，其中包括肿瘤学、免疫学研究等等。
细胞的感受态是指把转录因子的活性形式改变，使其响应环境刺激，
以调节其生化活性或特性。
感受态细胞制备的基本步骤是，首先收集需要制备的细胞株。
此外，设计环境因子，使细胞可以被富集于细胞培养液中，比如添加一
定量的表观遗传因子。
然后，将细胞培养液中的收集细胞用多种组合
方法，如离心法、细胞膜滤过法提纯细胞，最终得到所需的细胞株。
最后，移植所筛选出来的细胞株到环境中，使其进入感受态。
模
拟能够调节受体活性的外界刺激，对其进行诱导，使其进化到更加完
美的感受态细胞。
当准备好后，可以用于临床诊断、研究以及各种免
疫应答的研究等。
无论是医学上的准备，还是科学研究的准备，感受态细胞的制备
都是非常重要的。
人们可以通过改变细胞生长环境，调节外源基因活性，来改变细胞表达，以及形态和功能等，从而有效地控制细胞的生
长和发育。
感受态细胞制备的几种方法
感受态细胞制备的⼏种⽅法⼤肠杆菌感受态细胞的⼏种制备⽅法关于感受态细胞(Competent cells)常态的细胞不能摄⼊外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进⼊⼤肠杆菌必须⾸先制备感受态的⼤肠杆菌细胞。
受体细胞经过⼀些特殊⽅法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发⽣变化，成为能容许多有外源DNA的载体分⼦通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分⼦引⼊⼀细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的⼀种⼿段，是基因⼯程等研究领域的基本实验技术。
进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所⽤的受体细胞⼀般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有⼀个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转⼊可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各⾃都没有酶活性，但它们可以融为⼀体形成具有酶活性的蛋⽩质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产⽣的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作⽤于⽣⾊底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)⽽产⽣蓝⾊的菌落，所以利⽤这个特点，在载体的该基因编码序列之间⼈⼯放⼊⼀个多克隆位点，当插⼊⼀个外源DNA⽚段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作⽤，就不能产⽣具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为⽩⾊，⽽没有重组质粒的菌落为蓝⾊。
⼤肠杆菌感受态细胞的⼏种制备⽅法⽅法⼀：细菌转化的⽅法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本⽅法是⽤冰预冷的CaCl2或多种2价阳离⼦等处理细菌，使之进⼊感受态得以转化。
超级感受态细胞的制备方法
制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有前述菌株的1/10-1/5。
尽管如此，实际上对所有克隆方面的用途来说，这已绰绰有余。
一些大肠杆菌菌株（如ＭＣ1061）不适于此法。
下列有３个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：（１）转化缓冲液中试剂的纯度务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光保存于冷处。
（２）细胞的生长状态由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70┴冰冻培养基中的贮存原种接种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于４℃或贮存于室温的培养物。
（３）玻璃和塑料器皿的清洁度痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的生长效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。
这些玻璃器皿应用手洗刷，再灌满纯水（Ｍilli-Ｑ级或与其相当的级别），然后高压灭菌，临用前方把水倒掉。
细心操作的话，几乎总是可以获得转化效率高的感受态细胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108个转化菌落。
然而甚至经验最为丰富的工作者也不可能保证，有必要用标准的螺旋质粒ＤＮＡ制品来检测每一批新的感受态细胞的转化效率。
制备感受态细胞前，先制备一大批的螺旋质粒ＤＮＡ，分装成许多小份贮存于-70℃。
这些标准制品可用来检验每一批新的感受态细胞的转化效率，并检查每一个实验的转化效率。
设立这样一个阳性对照后，如果某一次实验得不到转化菌落，就可以根据对照的情况查明宣究竟是感受态细菌方面有庇漏，还是ＤＮＡ制品间有差异。
分装的感受态细菌可在-70℃保存几个月而转效率无明显下降。
１）用无菌铂丝直接蘸取冻存有大肠杆菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原种）（贮存于-70℃的冻培养基上，见附录Ａ），在SOB琼脂平板表面划线，于37℃培养16小时。
超级感受态细胞(大肠杆菌)-原理和制备Protocol
大肠杆菌超级感受态细胞原理和制备
所谓感受态，是指受体（或宿主）细胞最容易接受外源DNA片段而不将其降解并实现其转化的一种生理状态。
一. 原理：
人工感受态的形成, 需要低温和Ca2+处理，细胞膨胀成球状，细胞表面正电荷增加，
通透性增加，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列。
转化的质粒DNA 由于形成抗
DNase 的羟基-钙( Ⅱ) - 磷酸复合物而粘附于细胞表面。
Ca2+与膜上的多聚羟基丁
酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入。
cAMP可以使感受态水平提高10000倍，而Ca2+也可大大的提高转化的效率，在
Mg2+的辅助下Ca2+感受的细胞转化率比单用Ca2+处理的高1.84倍。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：
1）局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
2）酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：
二. 制备：
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在无菌低温下进行。
大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立
参考文献[1] 王向荣,林箐.西方现代景观设计的理论与实践[M ].北京:中国建筑工业出版社,2002.[2] 王晓俊.西方现代园林设计[M ].南京:东南大学出版社,2000.[3] 周向频.欧洲现代景观规划设计的发展历程与当代特征[J].城市规划汇刊,2003(4):49-56.[4] 唐军.从功能理性到公众参与)西方现代景观规划设计的社会脚印[J].规划师,2001,17(4):59-63.[5] Robert Holden.环境空间)国际景观建筑[M].蔡松坚,译.合肥:安徽科学技术出版社,1999.[6] 刘晓明,王朝忠.美国风景园林大师彼得#沃克及其极简主义园林[J].中国园林,2000(4):35-41.[7] 费蓄.极少主义绘画与雕塑[J].世界建筑,1998(1):63-67.[8] 罗枫,王晓俊.西方现代园林中的现代主义渊源[J].山西建筑,2005,31(2):202-203.[9] Peter Jacobs,Elizanbeth M eyer,M artha Schw artz.A Convergenc e of -ISM S .[J].Landscape Archi tecture,1990.[10]Brian Wallis,M arci a Tuckcr.Art after Modernism [M ].Due/Pub -lished,1986.[11]谢立中./现代性0及其相关概念词义辨析[J].北京大学学报,2001(5):23-25.Discu ssion of Main T rend s in W estern Mod ern Land scap e DesignL IU Hong -x iu,HU O Yan -hong(College of Light Industry,Hebei of Polytechnic U niversity,Tang shan,Hebei 063000)A bstract:After nearly one century development,w estern modern landscape has formed its own style and form which is different from traditional landscape.Widely affected by their modern landscape thought and design style,modern land -scape has gradually went out from tradition and formed some characteristics which are obviously different from the trad-i tional form.This paper talked about the main trends of western modern landscape design from five aspects.Key words:western modern landscape design;trend of design;modern and tradition;modern art第一作者简介:杨坤(1984-),男,陕西咸阳人,在读硕士,现主要从事蔬菜育种及生物技术研究工作。
电击法制备感受态细胞的原理
电击法制备感受态细胞的原理宝子！今天咱们来唠唠这个电击法制备感受态细胞是咋回事儿。
感受态细胞啊，就像是一群特别好客、特别容易接受新东西的小细胞。
那为啥要制备感受态细胞呢？这就像是我们要给细胞们一个特殊的状态，让它们能够愉快地接纳外来的DNA呢。
咱先说说细胞的细胞膜。
这细胞膜就像细胞的一道围墙，平时把细胞里面的东西好好地保护起来，不让外面乱七八糟的东西随便进去。
但是呢，我们想让它接受新的DNA呀，这可有点难办。
这时候，电击法就闪亮登场啦。
电击就像是给细胞来了一场超级震撼的小刺激。
你可以想象细胞们正悠闲地待着呢，突然“啪”的一下，来了一道电流。
这电流可不得了，它会让细胞膜的结构发生一些小变化。
细胞膜原本是那种比较严密的结构，就像紧紧锁着的大门。
电击之后呢，这大门就像是被震得松动了一些，出现了一些小小的缝隙。
这些小缝隙可太关键啦。
因为外来的DNA就像是一群小客人，一直在细胞外面晃悠，想进去呢。
以前细胞膜大门紧闭的时候，DNA小客人根本进不去。
现在好了，有了这些缝隙，DNA就有机会顺着这些小通道往细胞里面钻啦。
而且呀，细胞里面其实有各种各样的机制在等着这些外来的DNA呢。
当DNA顺着电击造成的小缝隙进去之后，细胞里面就像是一个热情的大家庭，开始接纳这个新成员。
细胞里面有很多蛋白质呀、酶呀之类的东西，它们就像是家里的管家和佣人，会来处理这个外来的DNA。
比如说，有些酶会把DNA好好地保护起来，防止它被破坏；还有些蛋白质会带着DNA到它该去的地方，就像带路的小向导。
不过呢，这电击可不能太猛了哦。
要是电击的强度太大，那就像是一场超级大灾难，细胞可能就直接被电死啦，那可就糟糕透顶了。
就像我们开玩笑说的，本来想给细胞开个小后门让DNA进去，结果用力过猛，把房子都给震塌了，细胞也就没法正常工作了。
还有哦，不同的细胞对于电击的耐受程度也是不一样的呢。
就像不同的人对刺激的接受能力不同。
有些细胞比较皮实，能够承受比较强一点的电击，还能好好地变成感受态细胞，欢迎DNA的到来；而有些细胞就比较脆弱，稍微强一点的电击就受不了啦，所以在进行电击法制备感受态细胞的时候呀，得好好研究一下这个细胞的特点，找到最适合它的电击条件。
超级感受态E.coli细胞制备
大肠杆菌（E.coli）超级感受态细胞制备H. Inoue, H.Nojima, and H. Okayama (1990)High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28溶液：SOB培养基 1L 500ml 1000 2％ Bacto tryptone 20g 10g0.5% yeast exctract 5g 2.5g10 mM NaCl 0.6g/L 0.3g2.5mm KCl 0.18g/L 250mM 5ml 10ml10mM MgCl2 2.03g/l. .6H2O 2M 2.5ml 5ml10mM MgSO4 2.46g/l. .7H2O 1M 10ml 20ml培养细菌用。
TB buffer (transformation buffer):10mM Hepes (or Pipes) 2.5g/l Hepes15mM CaCl2 2.27g/l (.2H2O)250mM KCl 18.6g/l55mM MnCl2 10g/l除MnCl2外，所有组分以固体加水中溶解和搅拌混匀，并以KOH调pH6.7，再将MnCl2溶解上述溶液中，用0.45μm滤膜抽滤除菌，存放于4℃备用。
4℃预冷所需的器皿：离心机转子、移液管、枪尖和eppendorf管。
步骤：1，取5ml SOB 加到100ml 的小烧瓶中，从新培养的平板上接种一个单克隆。
过夜培养。
2，在一个2L的烧瓶中加200ml SOB，接种预培养的菌液1ml。
在18℃，置于摇床剧烈振荡（200-250rpm）培养至OD660=0.6，大约需要1.5-2天。
（注：下面所有处理应该在低温下操作）3，将培养物和低温离心管放置冰中，10min，将培养物转到预冷的离心管中。
4，离心收集：4℃、3000rpm、10min。
去上清，倒置于面纸上。
inoue制感受态细胞
Inoue法制备超级感受态细胞(主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。
由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
)越干净越好，越冷越好将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。
用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。
高压灭菌。
准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。
高压灭菌。
于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。
可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。
晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。
超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml培养基（无抗性）中，18-22℃，200rpm摇过夜。
第二天上午测量细菌OD600值。
Top10, Jm109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（新手可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等，哪瓶到了用哪瓶，其它的可以狠心倒掉）。
将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。
4℃，4000rpm，10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。
超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，巨大力向下击打，尽可能去掉剩余LB。
每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。
在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者于感受态效率没有直接关系）。
超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀。
4℃，4000rpm，10min集菌。
超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），巨大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。
感受态细胞
现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA 分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2 法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。
转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。
1ng 的cccDNA 即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。
一般情况下,DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验以E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与pBS 质粒共保温,实现转化。
超级感受态细胞的制备方法
超级感受态细胞的制备方法什么是感受态细胞野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。
那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。
细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。
枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。
DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株Transformation "Ultra-Competent" E. coli (Inoue Method)Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene96:23-28. Citation AbstractProcedure步骤1. Inoculate from an overnight grown in LB.从培养过夜的LB 平板上挑取单菌落2. Grow in 250 ml "SOB" at 18C until OD600 = 0.6. (0.3) 接种于250mL SOB，18度培养至OD＝0.62. On ice for 10 minutes. 菌液置冰上10分钟3. Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA or 3000 rpmin a Beckman J-6B centrifuge) for 10 min. at 4C. 4度2500g离心10分钟4. Resuspend cells gently in 80 ml of ice cold "TB".小心用80mL预冷TB重悬细胞5. On ice for 10 minutes. (30min) 菌液置冰上10分钟6. Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA, 5500 rpm ina Sorvall SS-34, or 3000 rpm in a Beckman J-6B centrifuge) for 10 min. at 4C. 4度2500g离心10分钟7. Resuspend cells gently in 20 ml of ice cold "TB".小心用20mL预冷TB重悬细胞8. Add DMSO to a final concentration of 7%. 加入DMSO至终浓度7％9. Place on ice for 10 minutes. 置冰上10分钟10. Aliquot into 1-2 ml and freeze in liquid nitrogen.分装，液氮速冻11. Store in liquid nitrogen. 冻存SOB Medium and TB (Transformation Buffer)SOB2% (w/v) bacto tryptoneTB0.5% (w/v) yeast extract10 mM Pipes10 mM NaCl55 mM MnCl22.5 mM KCl15 mM CaCl210 mM MgCl2250 mM KCl10 mM MgSO4在加入MnCl2之前先用5N KOH调pH值到6.7，adjust pH to 6.7 with 5N KOH prior toadding the MnCl2thanks to Markus Schneemann for the tip!pH 6.7 - 7.0JM108感受态细胞的制备刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。
TOP10感受态细胞说明书
TOP10 感受态细胞说明书1.感受态细胞必须用干冰运输，融化后的感受态细胞不能再冻结储存。
如果用户收到感受态细胞后发现泡沫箱中的干冰已经挥发殆尽，应予以拒收。
2.收到感受态细胞后应立即储存在-70℃以下的冰箱中，在6个月内使用不影响转化效率；感受态细胞不可反复冻融，不要与限制性内切酶等经常使用的分子生物学试剂放在一起，避免因温度的波动而影响的效率。
技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：E-mail:technical@，电话：400-0099-857。
产品介绍本公司生产的TOP10感受态细胞是采用大肠杆菌TOP10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用DNA的化学转化。
经pUC19质粒检测，转化效率可达108cfu/μg。
每支感受态可以酌情分装使用，降低了实验的成本。
质量稳定，使用方便，质优价廉。
TOP10菌株介绍基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，ara Δ139Δ(ara-leu)7697，galU/galK ，rps，(Str R) endA1，nupG。
特点：本菌株是一种常用于质粒克隆的菌株。
适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
其φ80、lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。
质量标准1. 使用1 ng pUC19 Plasmid质粒DNA转化100 µl Competent Cells DH5α测试，产生的菌落数＞1×108 transformants/1µg pUC19 Plasmid 。
2. β-半乳糖苷酶、α-互补性的确认：对E.coli Competent Cells TOP10使用pUC19 DNA进行转化后，在含有100 µg/ml的Ampicillin、40µg/ml的X-Gal的L-琼脂平板培养基上，产生蓝色菌落。
trans5a感受态细胞说明书
trans5a感受态细胞说明书感受态细胞是一种新型细胞解剖学结构，它具有广泛的功能和应用。
在这篇文章中，我们将讨论关于感受态细胞的特点、应用领域和对人类生活的影响。
首先，感受态细胞具有高度的特异性。
它们能够感知和识别各种外界刺激，包括声音、光线、温度和压力等。
这种特异性使得感受态细胞在人类感官系统中起着重要的作用。
例如，听觉细胞能够感知声音的频率和强度，帮助我们听到和区分各种声音。
视觉细胞则能够感知不同的光线波长和强度，使我们能够看到和识别不同的物体和颜色。
感受态细胞的高度特异性使得我们能够通过感官系统获取丰富的信息。
其次，感受态细胞具有快速反应的能力。
一旦感受态细胞感知到刺激，它们能够迅速转化为相应的电化学信号，通过神经系统传递到大脑中进行处理和分析。
这种快速反应的能力使得我们能够在短时间内做出适应性反应。
例如，当我们听到危险的声音时，感受态细胞能够将这个信息快速传递给大脑，引发我们的注意和应激反应。
感受态细胞的快速反应能力有助于我们及时掌握和应对周围环境的变化。
此外，感受态细胞具有较好的适应性。
它们能够通过长期的刺激训练来提高对特定刺激的感知和识别能力。
这种适应性让我们的感官系统能够不断适应外界环境的变化。
例如，长时间暴露在光线强烈的环境中，我们的视觉细胞会逐渐适应这种强烈的刺激，减少对于光线强度的敏感度，从而使我们能够适应明亮的环境。
感受态细胞的适应性有助于我们在不同环境中更好地运用感官系统。
感受态细胞的应用领域十分广泛。
在医学领域，感受态细胞的研究可以帮助我们更好地理解感官系统的工作原理，进而研究和治疗感官系统相关的疾病和障碍。
在工业领域，感受态细胞的研究有助于开发更智能化的传感器和仪器，用于自动化控制和监测系统。
在生活中，感受态细胞的应用可以改善我们的感官体验，比如开发更先进的听力辅助设备和视觉增强技术等。
感受态细胞对人类生活的影响是巨大的。
它们使我们能够感知和理解世界，从而更好地适应和应对环境的变化。
克隆建库表达专用超级高效感受态细胞
克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。
我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。
实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。
生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。
Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。
XL10-Gold®用途包括：--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。
Hte 基因型Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。
XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。
超级感受态细胞Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。
电转化感受态细胞Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。
感受态细胞
感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
、CaCl2法：操作：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA 相粘附并在细胞表面形成复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA 分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化宁夏大学生命科学学院实验内容：利用化学转化法（CaCl2）制备感受态细胞，并进行转化检测感受态细胞的活性及转化效率。
实验目及原理：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA行程抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌防止在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型得到表达，然后将此细菌培养培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上培养观察。
实验仪器：超净工作台；低温离心机；恒温摇床；恒温箱；恒温水浴锅；-70度冰箱；制冰机；分光光度计；微量移液枪等。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂1.LB固体和液体培养基2.Amp母液3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
超级感受态细胞DH5α的制备
超级感受态细胞DH5α的制备制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞采用Inoue的方法（1990）制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法（1980）的转化效率。
但在标准的实验室条件下，达到l×108~3×108个转化克隆/ug质粒DNA的转化效率更为常见。
与Hanahan方法相比，这一方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重复性更好，而且更有预见性。
这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18℃进行培养而不是通常的37℃。
否则这个方法也就没有什么特别之处，而不过是一个司空见惯的标准程序。
没有人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。
也许是18℃时合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA，也许是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。
在18℃进行细菌培养并非易事，大多数实验室缺乏在夏天和冬天能够准确保持18℃的摇床。
将摇床置于4℃冷室，用温控器加温至18 ℃是一个解决问题的方法。
也可使培养物的温度维持在20~23℃，这样做并不会造成转化效率降低，这一温度在很多实验室其实是室温。
在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5~4h。
如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚间较迟的时候，这时细菌的OD600吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。
解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
分子克隆中常用的很多大肠杆菌品系都适用于这种方法，如XL-Blue、DH1、JM103、JM108/109、DH5a 和HB101。
材料注息：标记〈！〉试剂的正确操作，请参见附录12。
缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。
使用时将贮存液稀释至适当浓度。
二甲亚砜DMSO 〈！〉二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物（Hanahan 1985）。
为避免上述问题，应购买高质量的DMSO Inoue转化缦冲液（见步骤1)用前置于冰上预冷至0℃。
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克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。
我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。
实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。
生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。
Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。
XL10-Gold®用途包括：--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。
Hte 基因型Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。
XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。
超级感受态细胞Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。
电转化感受态细胞Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。
ElectroTen-Blue®细胞是目前商品化的电转化感受态细胞中效率最高的，达到>3 x1010转化子/μg 超螺旋DNA。
此外XL1-Blue，XL1-Blue MRF’，SURE®，ABLE® 和TG1等细胞也提供电转化形式感受态细胞。
SURE®－克隆不稳定DNA大肠杆菌DNA修复系统会针对重复序列、二级结构（如Z-DNA）等真核DNA进行重排或删除修饰。
SURE感受态细胞针对uvrC,umuC,SbcC和RecJ等参与修饰的大肠杆菌基因或蛋白进行突变，提高了真核来源、不规则DNA的稳定性达20倍以上，并且适合克隆甲基化DNA。
提供化学和电转化感受态细胞，效率分别达1x1010和1x109。
ABLE®－克隆毒性DNA目的DNA的蛋白产物常常对细胞产生毒性，通常的解决办法是采用低拷贝质粒，或者采用极为严紧的表达调控。
为了获得稳定的克隆，ABLE细胞减少ColE来源质粒的拷贝数（如pUC、pBluescript系列载体），以达到保持相对较高拷贝数的同时使本底表达对于细胞的毒性降至最低的效果。
MR系列®－克隆甲基化DNA真核基因组DNA常常因高度甲基化而被大肠杆菌修饰系统切割、删除，在构建文库时，由于要对cDNA进行甲基化保护，某些cDNA克隆也较难完成。
采用Stratagene的MR (Minus Restriction)突变删除了修饰系统的感受态细胞，可以构建质量非常高的cDNA和基因组文库。
这些细胞包括：用于大质粒克隆的XL10-Gold®超级感受态细胞，克隆连接DNA、转化效率目前最高的ElectroTen-Blue®电转化感受态细胞，单次反应包装的SoloPack® Gold，以及XL2-Blue MRF´，XL1-Blue MRF´ Kan（四环素抗性质粒），XL1-Blue MR（没有F´附加体），克隆有二级结构的SURE 细胞等。
重点推荐Stratagene的ElectroTen-Blue（转化效率>3×1010）和Novagen的Nova XG Zappers（转化效率>1×1010）电转化感受态细胞均具有endA－基因型，保证质粒优质高产；recA－重组缺陷基因型适合甲基化DNA克隆，确保片段不被删除或重排；能以IPTG诱导进行蓝白斑筛选（lacZΔM15），也使这两种细胞非常好用。
此外，ElectroTen-Blue还可被M13单链噬菌体感染（F’）。
感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议1、在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管。
1支用来转化样品，1支做pUC18对照。
同时将NZY+ broth培养基在42°C预热。
在转化实验中使用圆底14-ml BD Falcon聚丙烯试管（货号#352059）也是关键之一。
一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。
而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。
2、冰上融化感受态细胞。
融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管。
3、每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME（巯基乙醇）。
4、温和转动试管，将细胞在冰上放置10分钟，每2分钟温和转动一下。
5、每管细胞加入0.1–50 ng样品DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明。
)用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA，并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞。
6、温和转动试管，并在冰上放置30分钟。
7、试管在42°C水浴热激30秒。
热激时间对转化效率极度重要。
8、试管冰浴2 分钟。
9、每管加入0.9 ml 预热(42°C) 的NZY+ 肉汤，37°C、225–250 rpm 摇床培养1 小时。
10、取200 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板（如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal）。
pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板。
注意：细胞经1000 rpm离心10分钟会聚集，应将细胞沉淀用200 *l NZY+ 肉汤重悬。
如果用于铺板的细胞<100 ml，先将细胞加入200 ml培养基中，然后用灭菌涂布棒铺板。
如果采用?100 ml细胞则可以直接铺板。
倾斜涂布棒并轻轻拍打，尽量减少涂布棒上的细胞残留。
11、37°C培养过夜。
颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南。
12、pUC18阳性对照预计有约250个克隆（?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA）。
而样品DNA 的转化效率随DNA的量和组成（超螺旋或连接产物）有较大差异，大质粒和非超螺旋DNA往往得到较少的克隆。
高效感受态细胞制备方法一：效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
实验试剂：A液：1M，MnCl2B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
实验步骤：1、划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。
2、挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时。
3、将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多。
4、每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。
5、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
6、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
7、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
注意事项：1、洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
2、离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
3、涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
4、涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
5、预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要。
方法二：本法效率极高,建议大家采纳。
实验步骤：1、液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。
2、挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率。
3、在18度150-250RPM 培养19-50小时。
没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度。
4、OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟。
5、4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体。
6、去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟。
7、再次离心回收菌体。
8、用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上。
9、在液氮或-80度保存。
10、将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。
11、挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
12、当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
13、用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
14、重复第4步操作。
15、用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
16、冰浴10min后，分装保存于液氮中。