高中生物 考点加强课6 限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定

有
，不能表达的原因是_______________________________。
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图（c）
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有
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和
能连接黏性末端又能连接平末端的是_________________________________。
，其中既
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[慧眼识图 获取信息] （1）三种限制酶切割结果分析
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1.（2019·湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验 流程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种 酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。 请回答以下相关问题：
源DNA来自
。为了提高转染效率，应使用
处理细菌。
（3）图中②过程，重组DNA增殖时需要哪些条件？_________________。
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（4）图中③过程，筛选含重组质粒的细菌需用到
基因的功能。已知所用载体内有
青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，请写出能在含四环素的培养基上生长，但
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2.目的基因的检测与鉴定 （1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用： ①载体上标记基因的标记原理 载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相 关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内 表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就 可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当 然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：
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（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中 的_______________________________________________________________ 步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是______________________。 解析 （1）过程①获得的是人生长激素mRNA，所以组织细胞取自人垂体组织细胞；过程 ④ 构 建 基 因 表 达 载 体 的 酶 是 DNA 连 接 酶 ； 过 程 ⑤ 将 基 因 表 达 载 体 导 入 大 肠 杆 菌 前 ， 常 用 CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。（2）②过程是人的生长素mRNA逆转录 形成cDNA的过程。
不 能 在 含 青 霉 素 的 培 养 基 上 生 长 的 细 菌 即 为 含 外 源 DNA 细 菌 的 前 提 条 件 ：
__________________________________________________________________
___________________________________________________（答出两点即可）。
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②“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入？ 经上述步骤筛选得到的受体细胞，只是含特定的标记基因的质粒，然而，该质粒上是否成功 嵌入了目的基因，还不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，利用DNA分子杂交技术， 检测受体细胞的质粒上是否含目的基因。
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（4）在甲中能生长的是具有四环素抗性的细菌，含有四环素抗性基因；在乙培养基中能生 长的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，所以导入的是完整的pBR322质粒或含有Ampr、 Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆 菌成功导入了重组质粒，而且目的基因插入质粒后，破坏了氨苄青霉素抗性基因，使含有目 的基因的大肠杆菌不能在含有氨苄青霉素的乙培养基上生长，但四环素抗性基因是完好的， 则含有目的基因的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长。
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（3）Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ三种酶的切点分别用1、2、3表示，一种酶酶切时，一共 可以得到3种相同长度的片段；两种酶酶切时，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3 －1六种片段；三种酶酶切时，可得到1－2，2－3，3－1三种片段，与前面重复，因此用一 种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形 成的DNA片段种类相同。这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段 和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。
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1.限制酶的选择原则 2
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（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 ①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择 PstⅠ。 ②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择 SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和 质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的 切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。
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（2）使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定 mRNA。 （3）采用“抗原—抗体杂交技术”，从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相应抗体杂 交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。 （4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检 测。
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（2）表达载体与重组DNA分子分析 1
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答案 （1）Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 （2）甲、丙 甲中 目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能 被转录 （3）E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
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2.（2019·河南名校联盟调研）如图所示为培育转基因细菌的操作流程，回答下列问题：
（1）图中①过程所用工具酶有
。为了防止载体和外源DNA自连，应如
何操作？______________________________________________。
（2）当细菌的转化过程中吸收的外源DNA是病毒DNA时，该转化过程又称转染。图中外
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（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程中的筛选含 目的基因的受体细胞步骤。该基因工程中的pBR322质粒的化学本质是DNA，其彻底水解的 产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。 答案 （1）人垂体组织细胞 DNA连接酶 CaCl2 （2）cDNA （3）相同 3 3 （4）含四环素抗性基因 完整的pBR322质粒（或含有 Ampr、Tetr的质粒） 在丙中能存活，在乙中不能存活 （5）筛选含目的基因的受体细胞 磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基
（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被
酶切后的产物连接，
理由是________________________________________________________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA
分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的
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本节内容结束
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【例证】 （2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、 BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体 的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
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根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
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④ 所 选 限 制 酶 ， 其 切 点 应 位 于 启 动 子 与 终 止 子 之 间 ， 如 图 乙 中 HindⅢ 会 破 坏 启 动 子 ， EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子 之间。 （3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的 基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到 受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（两种酶切出的黏性末端不同） 切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、 丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）
类
（填“相同”或“不同”），这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性
基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有
种和
种。
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（4）如果只用限制酶Pst Ⅰ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不
含Ampr、Tetr），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签
挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，
菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选
的
大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的
是
。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是
_______________________________________________。
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（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类 4
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①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少 含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不宜选择。 ③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则 切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受 体细胞后不能自主复制。
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（1）过程①所用到的组织细胞是
，过程④所用的酶是
。⑤过程常用
溶液处理大肠杆菌。
（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为
。
（3）如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和
三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种
解析 根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源DNA应来自（DNA）病毒。另外，
限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。
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答案 （1）限制酶和DNA连接酶 应使用两种限制酶同时切割载体和外源DNA （2）（DNA）病毒 Ca2＋ （3）模板、原料、酶和能量等 （4）标记 原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源DNA插入到载体的青霉素抗性 基因内部