原核表达--宿主菌株选择指南
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:(1)选择标志的编码序列;(2)可控转录的启动子;(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);(4)一个多限制酶切位点接头;(5)宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
二、操作步骤(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT- PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
(三)获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法,可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程:1. 选择表达系统和载体:选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统(如E.coli),常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒:将目标基因克隆到选定的表达载体上,通常采用限制性内切酶切割和连接方法,确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌:将构建好的重组质粒转化入宿主菌中,一般选择适当的大肠杆菌菌株,如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液:将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中,进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化,包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达:在适当的生长阶段,向培养基中加入适量的诱导剂,常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
6. 细胞破碎:经过一定时间的表达后,收集培养菌液并将细菌进行破碎,释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂,避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化:通过一系列的蛋白纯化步骤,如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等,分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认:对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认,如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用:将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存,确保其稳定性和活性。
根据需要,可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是,原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外,对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间:2010-03-03 14:05:01 来源:作者:点击:1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:(1)选择标志的编码序列;(2)可控转录的启动子;(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);(4)一个多限制酶切位点接头;(5)宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
二、操作步骤(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA 第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
重组蛋白的表达系统(详细版)
终止子:转录终止子按照是否依赖和不依赖ρ因子的作用分为两类,这两类终止子均在终止点前含有一段7-20bp的回文序列。终止子可以保护mRNA在核外不被降解,显著延长mRNA的寿命,由此提高重组蛋白的表达量。但是对于T7系统来说,由于T7 RNA聚合酶效率极高,宿主中随时都有充足的mRNA以供翻译,因此大部分在T7系统中表达的重组蛋白并不在意质粒上是否有终止子,只有一些自身带有翻译起始信号的外源基因需要终止子。启动子受细胞类型的限制,在不同的细胞系中有很大不同,因此需根据宿主细胞(尤其是真核宿主)的类型选择不同的启动子以便于目的基因的高效表达。
表4:常用原核表达载体质粒
1.3 优化表达条件
重组蛋白的表达流程很少有一次成形的,为了提高蛋白表达量、改善蛋白质量,表达条件和白不表达时:
2
如果重组蛋白不表达(包含体和可溶蛋白都没有),首先检查cDNA和质粒是否正确,蛋白对宿主菌是否有很大毒性,然后尝试更换菌株、质粒载体和融合标签。原核蛋白在大肠杆菌中不能表达的情况很少见,通常是真核蛋白不能表达。不能表达的重组蛋白,即使在更换了宿主、载体后可以表达,表达量也不会很高,如果需要大规模生产,最好尝试酵母和昆虫细胞表达系统。
融合标签:融合标签是与目的蛋白共表达的一段多肽,方便重组蛋白的纯化、固定和检测,表3给出了常用的重组标签。如果不需要对重组蛋白进行纯化,尽量不要引入融合标签,以免影响蛋白性质;如果重组蛋白本身能够结合某种亲和柱,如某些金属结合蛋白可以结合Ni-NTA,某些糖结合蛋白能够特异识别糖类,也不必引入标签。融合标签的引入能够大大简化重组蛋白的纯化流程,并提高蛋白溶解度。商业化表达质粒,如pET、pGEX等提供了各种纯化标签和融合蛋白供选,应根据蛋白具体情况进行选择。His-tag是最常用的纯化标签,它具有很多优点:标签较短(10-20个氨基酸残基),不带电(pH8.0),免疫原性差,通常不影响重组蛋白的结构和功能,Ni2+亲和力高,能够通过一步纯化达到60%-90%的纯度。如果蛋白质溶解度不高,导致折叠困难、表达量低,可以选择较大的融合标签(GST、MBP、Trx等)帮助重组蛋白表达和折叠,提高重组蛋白溶解度,从而提高表达量。较大的融合标签有时也会导致翻译困难甚至提前中止,纯化后发现大部分都是标签蛋白也是常见现象。翻译的提前中止会大大影响重组蛋白产率和后续纯化,所以在短标签能够达到目的的时候,尽量不要选择大的融合标签。标签位置的选择也很重要:N端标签(短的或长的)自身带有启动子和适应宿主偏好的密码子,可以帮助目的蛋白表达,提高表达量,但是提前中止翻译的蛋白片段也会被一并纯化出来,降低重组蛋白纯度,对蛋白酶敏感的、自身容易降解的以及一级序列中有集中的疏水残基区的蛋白尤其要避免使用N端标签;C端标签则可以保证只有完整蛋白得到纯化。另外,如果蛋白的近N端或近C端有重要功能区,如酶活中心、配体结合位点、二硫键、多聚体稳定界面、相互作用界面等,则要避免纯化标签位于该末端,以免影响重组蛋白的结构和功能。如果融合标签对蛋白性质有较大影响,但又是纯化所必须的,就可以考虑在纯化过程中去除标签。主要有三种方法:化学裂解,如溴化氰(CNBr)、羟胺(NH2OH)等,能够简单有效地去除标签,但反应条件苛刻(羟胺需要在pH9.0下反应),特异性较差,而且会引入不必要的修饰,除包含体蛋白的处理外已经很少使用了;酶解,如PPase等,其底物一般是一段比较长的肽链,特异性强,是目前比较常用的方法,缺点是酶切反应需要较长的时间,也增加了蛋白纯化的步骤,使纯化变得繁琐;IMPACT质粒,该质粒在纯化标签和目的蛋白之间插入了一个蛋白质内含子(intein),intein具有可诱导的自切割活性,使用IMPACT质粒表达的重组蛋白,只需要改变缓冲液的pH和温度,即可切掉融合标签。
原核表达的注意事项
原核表达(网络文献)PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA)。
2. 注意事项:①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读,连续读下去,complete CDS读码是“M、、、、、、、、、*”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时,充分利用生物信息学的信息后,在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6-12 氨基酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性。
做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则:(1)、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
(3)、有弹性:许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤:(1)预测:如软件预测DNAstar(Protean)预测,Dnaman。
原核表达感受态细胞选用指南
原核表达感受态细胞选用指南1.Trans BL21(DE3) pLysS (适合有毒蛋白的表达)•产品说明Trans BL21(DE3) pLysS化学感受态细胞经特殊工艺制作,可用于DNA的化学转化。
细胞具有氯霉素(Camr)抗性。
使用pUC19质粒DNA检测,转化效率高达107 cfu/μg DNA。
使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能,表达蛋白大小为25 kDa。
•特点:该菌株带有质粒pLysS,具有氯霉素抗性。
此质粒含有表达T7溶菌酶的基因,T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰IPTG诱导的表达。
该菌株适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。
2.BL21(DE3)(实验室传统感受态细胞)•产品说明Trans BL21(DE3)化学感受态细胞经特殊工艺制作,可用于DNA的化学转化。
使用pUC19质粒DNA检测,转化效率高达107 cfu/μg DNA。
使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能,表达蛋白大小为25 kDa。
•特点:该菌株用于T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主,T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子,该区整合于BL21的染色体上。
该菌株适合于非毒性蛋白的表达。
3.Transetta(DE3)(适合稀有密码子序列的表达)(表达量高,无特殊要求的推荐优先选用)•产品说明Transetta(DE3)是采用进口菌株,特殊工艺制作,可用于DNA的化学转化。
细胞具有氯霉素(Camr)抗性。
使用pUC19质粒DNA检测,转化效率可达107 cfu/μg DNA。
使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能,表达蛋白大小为25 kDa。
•特点:该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)对应的tRNA,提高外源基因,尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
原核表达之宿主菌株选择指南
原核表达之宿主菌株选择指南在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。
事实上,在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因——即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。
作为原核表达的宿主,对外源基因的表达会产生一定的影响,是勿庸置疑的。
每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂,按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的,当出现问题时,我们需要经验判断问题所在。
宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?知其然还要知其所以然。
比如,菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。
堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。
大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。
真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。
改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)稀有密码子对应的tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
(已经携带有氯霉素抗性质粒)当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K–12衍生菌Origami 2系列,thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统,具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势,缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰,得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中,需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素,以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的,大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时,大多会在质粒载体或表达条件上找原因,而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主,菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株,可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子,多克隆位点,终止子,复制子,信号肽,融合标签,筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性,有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子:根据启动子的强弱考虑,强启动子可以提高蛋白表达量;弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑,组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白;诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子:终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解,延长mRNA的寿命,以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说,由于T7 RNA聚合酶效率非常高,保证一直有充足的mRNA 提供翻译,所以终止子对其影响不大,只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
~复制子:复制子决定质粒载体拷贝数,拷贝数越高,重组蛋白表达量就越高。
表达载体通常会选用高拷贝的复制子,但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间: 2019-06-03 新闻来源:将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:(1)选择标志的编码序列;(2)可控转录的启动子;(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点) ;(4)一个多限制酶切位点接头;(5)宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
二、操作步骤(一)获得目的基因1、通过PCR 方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法:用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ,以mRNA 为模板,逆转录形成cDNA 第一链,以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收,在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
原核表达之宿主菌株选择指南
原核表达之宿主菌株选择指南在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。
事实上,在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因——即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。
作为原核表达的宿主,对外源基因的表达会产生一定的影响,是勿庸置疑的。
每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂,按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的,当出现问题时,我们需要经验判断问题所在。
宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?知其然还要知其所以然。
比如,菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。
堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。
大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。
真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。
改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)稀有密码子对应的 tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
(已经携带有氯霉素抗性质粒)当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K–12衍生菌Origami 2系列,thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间:2010-03-03 14:05:01 来源:作者:点击:1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:(1)选择标志的编码序列;(2)可控转录的启动子;(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);(4)一个多限制酶切位点接头;(5)宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下:获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
二、操作步骤(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA 第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
(二)构建重组表达载体1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达菌株的选择及菌种保存需知
原核表达菌株的选择及菌种保存需知(Rosetta、BL21、Origami)从生物通上看到一篇文章,介绍原核表达菌株的选择。
文章很好,是生物通从M erck(Novagen隶属Merck旗下)的网站上编译而成的。
这里摘取其中我认为重要的地方,并添加了一些EMD (Emanuel Merck Darmstadt)原网站上的内容。
仅供参考。
在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。
(如上图)事实上,在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因——即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。
宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。
堪称经典的BL21系列就是lon和ompT 蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。
大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。
真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。
改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta 2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的七种(A UA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG)稀有密码子对应的 tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
(已经携带有氯霉素抗性质粒)当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K–12衍生菌Origami 2系列,thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达。
原核表达系统的选择和高效表达策略
大肠杆菌表达系统的几种表达方式
• 融合表达:表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签(Tag), 表达产物为融合蛋白(有分N端或者C端融合表达),方便后继的纯化 步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag(如GST)以获 得稳定表达;而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。 His-Tag是最广泛采用的Tag。
• 缺点:
• 大肠杆菌表达体系与其他表达体系相比, 也具有一些缺 • 点: ①高效表达易形成包涵体。②不能进行翻译后的加工
修饰, 如糖基化、磷酸化及酰基化等。
大肠杆菌表达系统的操作流程
大肠杆菌表达系统操作的一般程序如下: 获得目的基因-准备表达载体-将目的
基因插入表达载体中(测序验证)-转化 表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋 白的分析-扩增、纯化、进一步检测。
合倾向的中间体的浓度; (4)选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子,降低重组蛋白的合
成速度; (5)选择适合的宿主菌株; (6)表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白,提高可溶性; (7)蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关,因此可利用诱突
技术改变其氨基酸序列,提高目的蛋白的可溶性; (8)诱导过程中加入化学物质,以增加渗透压或改变培养基的pH值。
大肠杆菌表达系统的基本概念
• 对于做表达来说,如果不是要研究启动子的强弱,通常比较 少关心或者用到报告基因吧。绿色荧光蛋白是最常用的报告 基因了(注意选择适用原核表达版本的GFP),其他还有半 乳糖苷酶,荧光素酶等等。一些融合表达Tag也有报告基因 的功能。 启动子、终止子和核糖体结合位点: 启动子:启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之 一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac 和Tac,PL和PR,T7是最常用的启动子。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA)。
2. 注意事项:①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读,连续读下去,complete CDS读码是“M、、、、、、、、、*”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时,充分利用生物信息学的信息后,在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6-12 氨基酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性。
做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则:(1)、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
(3)、有弹性:许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤:(1)预测:如软件预测DNAstar(Protean)预测,Dnaman。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子.在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA)。
2. 注意事项:①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读,连续读下去,complete CDS读码是“M、、、、、、、、、*”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时,充分利用生物信息学的信息后,在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6-12 氨基酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性.做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则:(1)、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
(3)、有弹性:许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤:(1)预测:如软件预测DNAstar(Protean)预测,Dnaman.在线网站预测(http://www-bimas。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统,具有遗传背景清晰.表达周期快、表达量高、成本低等优势,缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰,得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要韧译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中,需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素,以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的,大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时,大多会在质粒载体或表达条件上找原因,而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主,菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽鞄杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株,可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子,多克隆位点,终止子,复制子,信号•肽,融合标签,筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性,有多种质粒可供选择。
P««A) B^217XI2S rrri TVIIIU 图2大肠杆菌表达质粒pET-22bG )图谱启动子:根据启动子的强弱考虑,强启动子可以提高蛋白表达量;弱启动子可以降低本 底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑,组成型启动子 使宿主不停的表达重组蛋白;诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子:终止子的作用在于保护mRNA 在核外不被降解,延长mRM 的寿命,以提高重组 蛋白表达量。
对于T7系统来说,由于T7 R51A 聚合酶效率非常高,保证一直有充足的mRNA 提供槪译,所以终止子对其影响不大,只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
复制子:复制子决定质粒载体拷贝数,拷贝数越高,重组蛋白表达量就越高。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA(cDNA)序列,有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因,找到同源蛋白,再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法,即得到蛋白,进行测序,然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征,找到启动子,编码区,终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子(cDNA).2。
注意事项:①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义,寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子;CDS可以是DNA上的定义,也可以是mRNA上的定义,分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读,连续读下去,complete CDS读码是“M、、、、、、、、、*”,partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时,充分利用生物信息学的信息后,在进行试验设计.二、抗原决定簇的预测1、原理:蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇.一般抗原决定簇是由6-12 氨基酸或碳水基团组成,它可以是由连续序列(蛋白质一级结构)组成或由不连续的蛋白质三维结构组成.变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物,用来免疫动物具有更强的抗原性.只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会有假阳性。
做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则:(1)、亲水性:大部分抗原决定簇是亲水性的。
(2)、处于结构表面:大部分抗体只与蛋白质表面部分结合.(3)、有弹性:许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域.3、选定抗原决定簇的步骤:(1)预测:如软件预测DNAstar(Protean)预测,Dnaman.在线网站预测(http://www-bimas.cit。
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统,具有遗传背景清晰.表达周期快、表达量高、成本低等优势,缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰,得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要韧译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中,需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素,以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的,大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时,大多会在质粒载体或表达条件上找原因,而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主,菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽鞄杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株,可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子,多克隆位点,终止子,复制子,信号•肽,融合标签,筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性,有多种质粒可供选择。
P««A) B^217XI2S rrri TVIIIU 图2大肠杆菌表达质粒pET-22bG )图谱启动子:根据启动子的强弱考虑,强启动子可以提高蛋白表达量;弱启动子可以降低本 底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑,组成型启动子 使宿主不停的表达重组蛋白;诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子:终止子的作用在于保护mRNA 在核外不被降解,延长mRM 的寿命,以提高重组 蛋白表达量。
对于T7系统来说,由于T7 R51A 聚合酶效率非常高,保证一直有充足的mRNA 提供槪译,所以终止子对其影响不大,只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
复制子:复制子决定质粒载体拷贝数,拷贝数越高,重组蛋白表达量就越高。
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作为原核表达地宿主,对外源基因地表达会产生一定地影响,是勿庸置疑地.每一个宿主细胞都像一个微观地小工厂,按照细胞固有地程序完成“你给它们安排地生产任务”――因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行地,当出现问题时,我们需要经验判断问题所在.宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?
知其然还要知其所以然.比如,菌株内源地蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物地不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想地起始表达菌株.堪称经典地系列就是和蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉地表达菌株.大名鼎鼎地()融源菌则是添加聚合酶基因,为表达系统而设计.文档收集自网络,仅用于个人学习
真核细胞偏爱地密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因地时候,真核基因中地一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低.改造基因是比较麻烦地做法,系列就是更好地选择―― 这种携带质粒地衍生菌,补充大肠杆菌缺乏地七种(及)稀有密码子对应地,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中地表达水平.(已经携带有氯霉素抗性质粒)文档收集自网络,仅用于个人学习
当要表达地蛋白质需要形成二硫键以形成正确地折叠时,可以选择衍生菌系列,()和()两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达.(卡那霉素敏感)文档收集自网络,仅用于个人学习
™ 则是综合上述两类菌株地优点,既补充种稀有密码子,又能够促进二硫键地形成,帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象地真核蛋白.(卡那霉素敏感)文档收集自网络,仅用于个人学习
是衍生自突变地菌株,这个突变能根据地浓度精确调节表达产物,使得表达产物量呈现浓度依赖性.(四环素敏感)文档收集自网络,仅用于个人学习
在决定试用这些名字古怪地菌株时,有几个小要注意地,一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性,要注意自己地表达质粒是否能与之兼容.比如已经携带有氯霉素抗性质粒,不能再用氯霉素筛选等等.文档收集自网络,仅用于个人学习
现象
可能原因
改进方案
建议菌株
无蛋白表达出现截短蛋白
. 地密码子偏移性
补充稀有密码子地;将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子
包涵体
二硫键形成困难
降低宿主胞质地还原性;利用促进二硫键形成地各种载体标签
表达过快,表达量过高
控制优化表达水平:降温,浓度优化
蛋白无活性
蛋白错误折叠
降低宿主胞质地还原性;利用促进二硫键形成地各种载体标签
控制优化表达水平:降温,浓度优化
细胞死亡,生长极困难
毒性蛋白
更严格地本底表达控制
菌株
无克隆生长
过高本底表达
更严格地本底表达控制
、菌株
重组质粒和菌株地保存建议
在实验室里保存重组菌株地时候,为了挑菌和传代方便,我们常用平板保存在℃冰箱中,需要提质粒和表达接种地时候,就直接从平板上挑菌,但是这种方法对于重组质粒地稳定性不利,容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况.我们建议:文档收集自网络,仅用于个人学习
、长期存放菌株和重组子应该存在甘油-℃保种.但是要注意高浓度甘油(> )会导致质粒不稳定.请尽量保持甘油浓度.(浓度地甘油保种液和新鲜菌液就行)文档收集自网络,仅用于个人学习
、重组质粒不宜长期保存于表达菌株(带地大肠杆菌)中,请尽量使用带有突变地克隆菌株(比如,)进行质粒抽提和保存质粒.表达型地菌株提质粒经常会有质量不高或者背景地问题.特别是大量抽提.文档收集自网络,仅用于个人学习
其实不仅仅是表达,建库克隆都会涉及菌株地不同要求,推荐看看以下文章:克隆建库专用超级高效感受态细胞.感受态不是目地,菌株地背景才是关键.文档收集自网络,仅用于个人学习。