Tan第五章 目的基因的导入和重组子的筛选
第5章 基因工程基本流程-筛选与鉴定
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选择过程
1）从重组克隆中提取质粒（或基因组DNA） 2）用相应引物进行PCR反应 3）电泳PCR产物 4）检查是否有PCR产物 5）PCR产物的长度是否与外源基因一致 原理图p58
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2. Southern blot杂交
原理： 从宿主细胞中提取 DNA （或质粒载体），再用特
异性探针（与目的基因同源）进行核酸杂交。只
3. western blotting 原理： 蛋白——蛋白杂交 选择过程
western blot过程
48
单抗blotting结 果
多抗Blotting结果
49
4. 蛋白凝胶电泳 原理： 待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳 结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受 体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。
9
选择过程
10
-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。
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3. 营养缺陷型筛选法 原理 载体能够合成某些生长必须营养成分， 受体菌基因突变不能合成这种生长必须的营养物质。 在缺少该营养物质的培养板上涂布细菌，长出的菌落
均含有载体的，是否重组子需进行第二轮筛选。
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选择过程
营养合成型载体
营养缺陷型受体
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选择过程 在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性 的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA 双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。
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缺点：需要电镜
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5. Northern blotting
原理：
从宿主细胞中提取 RNA，
再用探针杂交。
主要检测插入片断是否
被转录。检测表达载体。
表型筛选加酶切筛选
T A A T
Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选
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5.4 重组子筛选的方法
5.4.1 遗传表型直接检测法 5.4.2 依赖重组子结构特征分析的筛选法 5.4.3 基因表达产物分析法 5.4.4 DNA序列测定法
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5.4.1 遗传表型直接检测法
• 根据载体的选择标记的初步筛选 • 根据插入序列的表型特征筛选重组子
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• （四）根据λ基因组的大小筛选 λ装配系统，只有37kb-52kb的DNA分子可
以进入头部结构，小于37kb的不能装配。许多 构建的λ载体切除了部分DNA，因而小于37kb， 只有插入外源DNA分子后才能被装配到头部结 构中，使载体的长度等于或大于37kb。对于这 样的λ噬菌体载体，只有重组的噬菌体才能进行 正常的复制。
• 除感受态细胞制备及转化与化学法不同之外，其余步骤包 括所设转化对照与化学法相均相同。
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5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
• 转化率： 是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。
• 转化率计算： ＝转化子总数/DNA分子总数或质量
或 ＝转化子总数/受体细胞数 • 实际中按转化子总数/DNA分子质量(g)计算
本课程内容
• 第一章 绪论 • 第二章 基因克隆的工具酶 • 第三章 基因工程的载体 • 第四章 目的基因的制备 • 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 • 第六章 外源基因的表达 • 第七章 基因操作的基本技术 • 第八章 植物基因工程及应用 • 第九章 动物基因工程及应用 • 第十章 医学基因工程及应用
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基因工程5-重组子筛选(中国药科大学生物工程所有课件)
二抗 二抗上联着一种酶
（碱性磷酸酶、过 氧化物酶、脲酶 等）。
显色反应：加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反 应转变成有色物质（或发光）。 比色：在特殊的分光光度仪 （酶标仪）上比色，打印出 结果。
3.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
四、原位杂交
1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中 的核酸进行杂交，称原位杂交。根据探针与待检核 酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA 杂交
探针（Probe)的概念: 一段带有检测标记的与目 的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
（1）菌落印记原位杂交筛选
特点： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
待测基因 产物蛋白
一抗
二抗
酶
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
2. ELISA检测的一般步骤
固定样品:将待测样品加入96孔微量滴定板 （microtiter plate）的孔中，干燥后就被固 定在孔底。 一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的 抗体。
孔底
一抗
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二 二抗结合：抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
2. 选择过程
假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有 中止密码；（不破坏肽）。
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道 是否有DNA插入。
无质粒的 受体菌
-半乳糖苷酶 部分缺失，不 能分解Xgal； 无抗菌素抗性
（2)Southern blotting
目的基因的克隆转化及重组子筛选
实验报告题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选指导老师:丛佩清日期:2013/10/24-2013/10/26一．实验目的：(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。
(2)学习DNA连接的有关技术。
(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。
(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
(5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
二．实验原理：(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。
可用于PCR产物的克隆和测序。
(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。
(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。
诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。
三．实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1µl pMD19-T Vector、5µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅱ、350µlSolution Ⅲ、HiBind ® Mini Columns (I)、500 µlBuffer HB、1400 µlDNA Wash Buffer等四．实验步骤、现象、结果及分析：Ⅰ10月24号(1)cDNA电泳及胶回收1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2µl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。
何水林版基因工程第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG CCTAGGCGC BamH I位点
-3’
-5’
3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
4. DEAE-葡萄糖转染法 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能 促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。
葡聚糖
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++
++ ++++++ ++ + + + 二乙氨乙基 + + （DEAE） ++ ++ ++++ - - - -- - DNA - - --- -
4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。
操作步骤： 10ng 载体DNA 100L 感受态细胞 10-100L转化液 涂Amp＋平板
（p140）
吸附DNA 冰浴30min
摄入DNA 42℃ 1~2min
37℃ 振荡培养1h
加入1mL LB培养基 （Amp-）
转化率：106-108/g DNA
（一）转化率的计算：
转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量
基因工程作业(引物设计)讲解
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。
方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。
结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。
结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA GraphicsLOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorillaEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computationalanalysis. This record is derived from a genomic sequence(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,supported by mRNA and EST evidence.Also see:Documentation of NCBI's Annotation Process##Genome-Annotation-Data-START##Annotation Provider :: NCBIAnnotation Status :: Full annotationAnnotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipelineAnnotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA##Genome-Annotation-Data-END##FEATURES Location/Qualifierssource 1..2872/organism="Gorilla gorilla gorilla"/mol_type="mRNA"/sub_species="gorilla"/db_xref="taxon:9595"/chromosome="14"gene 1..2872/gene="MTA1"/note="Derived by automated computational analysis usinggene prediction method: GNOMON. Supporting evidence/codon_start=1/product="metastasis-associated protein MTA1"/protein_id="XP_004055849.1"/db_xref="GI:426378239"/db_xref="GeneID:101134898"/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgccgcgccgagcg ccgcgcccgcaacatgtaca gggtcggaga241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccctgcgcccgtca acgacgagccgccccccgcc cctcgcccgc2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa//三、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。
重组子的筛选与鉴定
产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin） （蓝灰色）褪色。
2020/7/30
（1）四环素抗性插入失活
当外源DNA限制片段插入pBR322质粒的BamH I和Sal I位点时，抗 四环素基因失活，重组体转化子必定具有Ampr Tets表型。将转化 菌先涂布在含有Ampr的琼脂平板上并将存活的Ampr菌落原位影印 到另一个含有Tet的琼脂平板上，凡是在Ampr平板上生长，而不在 Tet平板亡生长的菌落，就必定是已经插入了外源DNA限制片段的重 组质粒2020转/7/3化0 子克隆。
2020/7/30
第二节 核酸分子杂交检测法 • 1 原理 • 2 核酸杂交检测方法
2020/7/30
• 利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手 段，也是鉴定基因重组体的常用方法。杂交的双方是待 测的核酸序列和由插入片段基因制备的DNA或RNA探针 。
• 这些方法都是通过一定的物理方法将菌落(噬菌斑)或提 取的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同 液体中的探针进行杂交。菌落(噬菌斑)或DNA从平板或 凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故这些杂交又都称为 印迹(blotting)杂交。
2020/7/30
1、原理： 1.1 核酸杂交 重组克隆与探针杂交。 1.2 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 1.3 识别标记
-半乳糖苷酶 Xgal
2020/7/30
半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点(MCS)区，本身 虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止 LacZ’的合成。不能互补。
2020/7/30
基因工程原理-第5章重组基因导入受体细胞
转化率＝
转化子 DNA分子数
＝
Ca2+诱导大肠杆菌转化法
① 低温下使磷质层形成液晶结构， Ca2+： 使膜间核酸酶分离 ② 与DNA结合，抗DNase
（1）感受态的制备
对数生长后期的菌体 5x107个/毫升
冰浴10分钟
含CaCl2缓冲液 15分钟 含CaCl2缓 冲液
（3）筛选转化子。
（2）DNA分子转化感受态细胞
菌间接合转移的有关基因
tra。
（Vir 区）
（Con区）
出毒性。占Ti质粒 1/3。
Ori区 ——复制起始区。
外源基因
Ti质粒载体
限制性酶 切开
（1）叶盘法转化植物细胞
（2）整体植株接种转化法
人为地在整体植株上造
成创伤部位，然后把农杆菌
接种在创伤表面，使农杆菌 按照天然的感染过程在植株
体内进行侵染。获得转化的
CHO，猴肾细胞等
• 受体动物：鼠、牛、羊、鱼等
第二节 重组基因导入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
接受DNA片段
（一）转化
1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证
明了遗传的物质基础是DNA。
转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受 体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受 体菌，称转化子。 转化子 细胞数
（二）植物病毒介导基因转移 DNA病毒20%
植物病毒
RNA病毒80%
花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒
（三）化学诱导DNA直接转化 （1）多聚物介导法 聚乙二醇 多聚赖氨酸 多聚鸟苷酸
（2）脂质体介导基因转化
脂质体
（四）物理方法介导DNA直接转化 （1）基因枪转化
重组基因向受体细胞导入与重组子的筛选
第一节 受体细胞的选择
1. 受体细胞的概念
受体细胞(receptor cell)又称为宿主 细胞或寄主细胞(host cell)，从实验 技术上讲是能摄取外源DNA并使其维持 稳定的细胞；从实验目的上讲是有应用 价值和理论研究价值的细胞。
2. 受体细胞应具备的条件
(5)安全性高，无治病性，不会对外界环源自造成生 物污染：感染与寄生缺陷型；
(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在细胞内的积累。 尤其是对枯草芽孢杆菌。
(7) 受体细胞的密码子偏倚性要小； (8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基
因的高效表达。如：糖蛋白不能在E.coli中表达；
(9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值； (10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用
已成功表达人β干扰素，白细胞介素，乙型肝炎病 毒核心抗原等。
3.2 真菌细胞
真菌是低等真核生物，其基因结构、表达机制及 蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因 此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核细 胞受体不可比拟的优越性。
常用的真菌细胞受体为酵母菌。
优势：结构简单，表达调控机理清楚，遗传操作
Section 3 Screening and Identification of Recombinant Clone
目的序列与载体DNA正确连接的效率 重组导入细胞的效率
最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至很小 一部分是含有目的序列的重组体(recombinant)。
将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的 克隆，所以筛选(screening)是基因克隆的重要步 骤。
DNA分子转化感受态细胞：向0.2mL感受态细胞中 加入0.1mL(不超过50ng)的质粒DNA，继续冰浴 30min，然后在42℃进行1.5-2min热激（heat shock）,以促进DNA分子的吸收
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
Tan第五章目的基因的导入和重组子的筛选
9/23/2020
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5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
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5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）
• 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境
中DNA分子的生理状态的细胞。 处理。菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2
• DNA分子转化感受态细胞：
冰浴、42ºC热激、37 ºC恢复、涂板培 养。
9/23/2020
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5.3.1.1 细菌转化的机制
• 转化(transformation)：
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体
细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为
转
化
。
自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主
要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的
转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和
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• 宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将 重组克隆鉴定出来。
• 把重组DNA导入受体细胞进行扩增
• 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞
及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、
转染和转导。
9/23/2020
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基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
基因工程目的基因的分离和获得和重组酵母 菌形及其周围限制酶切位目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
基因工程目的基因的分离和获得和重组增特定生物基因组 全部或个别片段，保留物种遗传种质。2.从基因中调出其中任何DNA片段或目标基 因。
3.构建基因是研究基因本身需要,如基因结构 分析、基目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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（四）重组连接
制备出适当大小随机性基因组DNA与载体左臂右臂 进行连接，NA Sau3A I末端互补连接。
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基因分离和取得常见方法
一、基因分离物理方法 二、鸟枪法(Sh因化学合成 六、聚合酶链反应技术（PCR）
基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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一、基因分离物理方法
依据DNA分子两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。
如DNA分子中某段G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就 高，其溶解温度（Tm）就高。这么，大家经过控制溶解 温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。 当利用单链核酸酶S，酶去除解开单链个别，得到富 G≡C区DNA片段 。
基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法
基因工程目的基因的分离和获得和重组基因的导入
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鸟枪法克隆目标基因基础战略
1、随机酶切成基因相当大小片段（约 1000bp)；
2、重组入适当载体（质粒）；
3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增；
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5/11/2015 8:30 AM
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5.1.3 DNA重组中需注意的问题
• 两端具相同粘性末端的 DNA 分子会发生自 身环化。 • 对于置换重组，需将切割的 DNA 分子经过 凝胶电泳分离，回收目的片段。
• 无论单酶切还是双酶切，目的 DNA 分子均 可能发生串联，必需检测重组 DNA 插入片 段的分子大小。
• 原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔
（ electroporation ），形成可逆的瞬间通道，促进外源 DNA 的有效吸收。 • 特点：
1. 感受态细胞制备简单； 2. 转化率高达109～1010个转化子/g质粒DNA；
3. 用途广泛，但需特殊仪器电激仪。
• 除感受态细胞制备及转化与化学法不同之外，其余步骤包 括所设转化对照与化学法相均相同。
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利用lacZ'基因的插入失活筛选重组噬菌斑
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5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞 • 重组DNA分子导入植物细胞－植物基因工程 (见后面第八章) • 重组DNA分子导入哺乳动物细胞－动物基因 工程(见后面第九章)
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5.3 基因转移（gene transfer）
• 载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分 子： a. 未连接的载体分子 b. 未连接的DNA片段 c. 载体的自连 d. 含有错误插入片段的重组DNA分子 e. 重组DNA分子 转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细 胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特 殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片 段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入
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c. d. e. f.
高压电穿孔法转化 显微注射法转化 接合转化 噬菌体转染
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表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较
转 化 方 法 Ca 诱 导 原生质体转化
转 化 效 率 107-8 105-6
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5.2 受体细胞及其选择的基本原则
5.2.1 受体细胞 5.2.2 受体细胞选择的基本原则
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5.2.1 受体细胞 • 受体细胞（receptor cell）：又称为宿 主细胞或寄主细胞（host cell） • 从实验技术上讲：是能摄取外源DNA 并使其稳定维持的细胞。 • 从实验目的上讲：是有应用价值和理论 研究价值的细胞。
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影响转化效率的因素
受体细胞的感受态，它决定转化因子能否被吸 收进入受体细胞； 受体细胞的限制酶系统和其 他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被 分解；
受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子 的整合； 重组DNA 分子大小
重组DNA纯度、浓度
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λ 噬菌体体外装配的两种系统
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欢迎同学们听课！Leabharlann Slide 28噬菌斑
• λ 和M13噬菌体都能形成噬菌斑，λ 形成的 是真正的噬菌斑(透明)，是由于细胞的裂解引 起的；而M13的噬菌斑是浑浊的，因为细胞并未 裂解，它引起的是细菌生长的减慢，而使细菌 的浓度低于周围细胞。
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5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素 • 转化率：
是指 DNA 分子转化受体菌获得转化子的效率。
• 转化率计算：
＝转化子总数/DNA分子总数或质量
或 ＝转化子总数/受体细胞数
• 实际中按转化子总数/DNA分子质量(g)计算
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第五章 目的基因导入和重组子的筛选
5.1 DNA片段的连接重组
5.2 受体细胞选择的基本原则
5.3 基因转移
5.4 重组子的筛选
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5.1 DNA片段的连接重组
5.1.1 DNA连接类型 5.1.2 DNA片段之间连接的方式 5.1.3 DNA重组中需注意的问题
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重组噬菌体的鉴定
• （一）利用插入失活鉴定 M13噬菌体，多种λ噬菌体载体都含有lacZ’基因， 可以通过插入失活鉴定重组噬菌体。 （二）λ噬菌体的cI基因的插入失活 λ噬菌体载体在cI基因位点上含有单一的酶切位点， 该位点上插入外源基因可以导致该基因的失活，引起 表现型的变化。正常的噬菌斑是浑浊的，但重组的噬 菌斑是清亮的。 （三）利用Spi(sensitive to P2 inhibition)表型选择 一般来讲，λ噬菌体不能侵染已被P2噬菌体侵染的 大肠杆菌细胞，因此λ噬菌体被称为Spi+（对P2前噬菌 体抑制敏感），插入新的DNA后，能变成spi-，可以侵 染含有P2噬菌体的细菌，只有重组子是Spi-可以形成噬 菌斑，因此可以很方便的选择出来。
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5.3 基因转移（gene transfer）
5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.3.2 重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞
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5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
• 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境 中DNA分子的生理状态的细胞。 菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2 处理。 • DNA分子转化感受态细胞： 冰浴、42º C热激、37 º C恢复、涂板培 养。
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5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法）
本课程内容
• 第一章 绪论 • 第二章 基因克隆的工具酶
• 第三章 基因工程的载体
• 第四章 目的基因的制备 • 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 • 第六章 外源基因的表达 • 第七章 基因操作的基本技术
• 第八章 植物基因工程及应用
• 第九章 动物基因工程及应用 • 第十章 医学基因工程及应用
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• 体外装配（in vitro packaging）：λ DNA的转染 效率不高，如果将重组的λ分子装配成头-尾结 构的病毒粒子，将极大的提高效率。
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噬菌体转化大肠杆菌的方法
5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
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5.3.1.1 细菌转化的机制
• 转化(transformation)： 重组质粒 DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体 细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为 转 化 。 自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主 要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的 转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和 吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大 肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率， 建立了一系列的转化方法： a. 热激法转化感受态细胞 b. PEG介导的原生质体转化
(2) 载体上有两个不同的酶识别位点
定向置换
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5.1.2 DNA片段之间连接的方式 • 具互补黏性末端片段之间的连接
• 具平末端DNA片段之间的连接
• DNA片段末端修饰后进行的连接
• DNA片段加linker or adaptor后的连接
噬菌体转化
电 穿 孔 法 结 合 转 化
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107-8
106-9（<100Kb） 104-5
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5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转 化法）
• 原理：0º C、低浓度（50～100 mM）CaCl2，Ca2+改
变细胞膜的磷脂层结构，提高膜的通透性，而且增强
5/11/2015 8:30 AM
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5.2.2 受体细胞选择的原则
• • • • • • • • • • 外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型； 重组基因缺陷型； 易于转化/ 转导； 易筛选 遗传稳定性高，易于扩大培养； 安全性高； 内源蛋白酶基因缺失或缺陷； 遗传密码无明显偏好性； 具有较好的转译加工机制； 较高的理论和实践应用价值。
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5.3.2 重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌
• 转染(transfection)： 采用与质粒 DNA 转化受体细胞相似的方法， 将重组 噬菌体 DNA 分子直接导入受体细胞中的过 程，称为转染。 效率较低，103～104个噬菌斑/ g DNA ，较难 满足一般实验要求，实践中少用。 • 转导(transduction)： 是指通过 噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞 的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。 效率高，可达103～104个噬菌斑/ g DNA，需 进行体外包装。