Tan第五章 目的基因的导入和重组子的筛选

噬菌体转化
电 穿 孔 法 结 合 转 化
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
107-8
106-9（<100Kb） 104-5
Slide 17
5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转 化法）
• 原理：0º C、低浓度（50～100 mM）CaCl2，Ca2+改
变细胞膜的磷脂层结构，提高膜的通透性，而且增强
进入细胞的DNA分子抗DNase的能力。
特点：操作简便，不需特殊仪器，一般实验室均可进
行。转化率在5106～2 107个转化子/g质粒DNA范围
内，完全可满足常规克隆的需要。
ห้องสมุดไป่ตู้
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 18
5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法）
Slide 12
5.3 基因转移（gene transfer）
5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌 5.3.2 重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 13
5.3.1 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 27
λ 噬菌体体外装配的两种系统
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 28
噬菌斑
• λ 和M13噬菌体都能形成噬菌斑，λ 形成的 是真正的噬菌斑(透明)，是由于细胞的裂解引 起的；而M13的噬菌斑是浑浊的，因为细胞并未 裂解，它引起的是细菌生长的减慢，而使细菌 的浓度低于周围细胞。
欢迎同学们听课！
Slide 21
影响转化效率的因素
受体细胞的感受态，它决定转化因子能否被吸 收进入受体细胞； 受体细胞的限制酶系统和其 他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被 分解；
受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子 的整合； 重组DNA 分子大小
重组DNA纯度、浓度
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
• 感受态细胞制备： 感受态细胞：指处于能吸收周围环境 中DNA分子的生理状态的细胞。 菌种活化、培养、收菌和进行CaCl2 处理。 • DNA分子转化感受态细胞： 冰浴、42º C热激、37 º C恢复、涂板培 养。
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 19
5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法）
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 7
5.2 受体细胞及其选择的基本原则
5.2.1 受体细胞 5.2.2 受体细胞选择的基本原则
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 8
5.2.1 受体细胞 • 受体细胞（receptor cell）：又称为宿 主细胞或寄主细胞（host cell） • 从实验技术上讲：是能摄取外源DNA 并使其稳定维持的细胞。 • 从实验目的上讲：是有应用价值和理论 研究价值的细胞。
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 29
重组噬菌体的鉴定
• （一）利用插入失活鉴定 M13噬菌体，多种λ噬菌体载体都含有lacZ’基因， 可以通过插入失活鉴定重组噬菌体。 （二）λ噬菌体的cI基因的插入失活 λ噬菌体载体在cI基因位点上含有单一的酶切位点， 该位点上插入外源基因可以导致该基因的失活，引起 表现型的变化。正常的噬菌斑是浑浊的，但重组的噬 菌斑是清亮的。 （三）利用Spi(sensitive to P2 inhibition)表型选择 一般来讲，λ噬菌体不能侵染已被P2噬菌体侵染的 大肠杆菌细胞，因此λ噬菌体被称为Spi+（对P2前噬菌 体抑制敏感），插入新的DNA后，能变成spi-，可以侵 染含有P2噬菌体的细菌，只有重组子是Spi-可以形成噬 菌斑，因此可以很方便的选择出来。
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 15
c. d. e. f.
高压电穿孔法转化 显微注射法转化 接合转化 噬菌体转染
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 16
表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较
转 化 方 法 Ca 诱 导 原生质体转化
转 化 效 率 107-8 105-6
本课程内容
• 第一章 绪论 • 第二章 基因克隆的工具酶
• 第三章 基因工程的载体
• 第四章 目的基因的制备 • 第五章 目的基因导入和重组子的筛选 • 第六章 外源基因的表达 • 第七章 基因操作的基本技术
• 第八章 植物基因工程及应用
• 第九章 动物基因工程及应用 • 第十章 医学基因工程及应用
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 30
• （四）根据λ基因组的大小筛选 λ装配系统，只有37kb-52kb的DNA分子可 以进入头部结构，小于37kb的不能装配。许多 构建的λ载体切除了部分DNA，因而小于37kb， 只有插入外源DNA分子后才能被装配到头部结 构中，使载体的长度等于或大于37kb。对于这 样的λ噬菌体载体，只有重组的噬菌体才能进行 正常的复制。
Slide 22
5.3.2 重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌
• 转染(transfection)： 采用与质粒 DNA 转化受体细胞相似的方法， 将重组 噬菌体 DNA 分子直接导入受体细胞中的过 程，称为转染。 效率较低，103～104个噬菌斑/ g DNA ，较难 满足一般实验要求，实践中少用。 • 转导(transduction)： 是指通过 噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞 的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。 效率高，可达103～104个噬菌斑/ g DNA，需 进行体外包装。
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 11
• 宿主细胞进行正常的复制。因此，需要将 重组克隆鉴定出来。 • 把重组DNA导入受体细胞进行扩增
• 根据所用载体的特性选择适宜的受体细胞
及选择适宜的重组DNA导入的方式：转化、 转染和转导。
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 25
噬菌体转化大肠杆菌的方法
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 26
λ 噬菌体的体外装配
•
有两种不同的系统可以应用： 一种是cos位点突变的噬菌体的单品系系统。 另一种系统需要两种不同的缺陷品系一个 是基因D的突变体，另一个品系是基因E的突变 体，由于蛋白质合成的缺陷。体外的装配过程 可以利用两种不同培养物的混合物，含有完整 的外壳蛋白，完成装配过程。将装配的噬菌体 接入细菌就可以完成正常的侵染过程。
5.3.1.1 细菌转化的机制 5.3.1.2 化学转化法（CaCl2诱导大肠杆菌转化法） 5.3.1.3 电激法（电穿孔转化法） 5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 14
5.3.1.1 细菌转化的机制
• 转化(transformation)： 重组质粒 DNA 分子通过与膜蛋白结合进入受体 细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为 转 化 。 自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主 要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的 转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和 吸收的代谢机制。正常条件下，大部分细菌包括大 肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率， 建立了一系列的转化方法： a. 热激法转化感受态细胞 b. PEG介导的原生质体转化
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 20
5.3.1.4 转化率的计算及其影响因素 • 转化率：
是指 DNA 分子转化受体菌获得转化子的效率。
• 转化率计算：
＝转化子总数/DNA分子总数或质量
或 ＝转化子总数/受体细胞数
• 实际中按转化子总数/DNA分子质量(g)计算
5/11/2015 8:30 AM
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 33
5.4 重组子筛选的方法
5.4.1 遗传表型直接检测法
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 3
DNA分子连接
不同的DNA片段（目的基因和载体）经适 当酶切后，在连接酶的作用下，连接在一起构 建成重组DNA分子 。
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 4
5.1.1 DNA重组（连接）的类型
• 插入重组: 载体上只有唯一的酶识别位点 随机（非定向）插入 • 置换重组 (1) 载体上有两个同样的酶识别位点 随机（非定向）置换
• 原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜上进行电穿孔
（ electroporation ），形成可逆的瞬间通道，促进外源 DNA 的有效吸收。 • 特点：
1. 感受态细胞制备简单； 2. 转化率高达109～1010个转化子/g质粒DNA；
3. 用途广泛，但需特殊仪器电激仪。
• 除感受态细胞制备及转化与化学法不同之外，其余步骤包 括所设转化对照与化学法相均相同。
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 31
利用lacZ'基因的插入失活筛选重组噬菌斑
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 32
5.3.3 重组DNA分子转入真核细胞 • 重组DNA分子导入植物细胞－植物基因工程 (见后面第八章) • 重组DNA分子导入哺乳动物细胞－动物基因 工程(见后面第九章)
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 6
5.1.3 DNA重组中需注意的问题
• 两端具相同粘性末端的 DNA 分子会发生自 身环化。 • 对于置换重组，需将切割的 DNA 分子经过 凝胶电泳分离，回收目的片段。
• 无论单酶切还是双酶切，目的 DNA 分子均 可能发生串联，必需检测重组 DNA 插入片 段的分子大小。
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 9
5.2.2 受体细胞选择的原则
• • • • • • • • • • 外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型； 重组基因缺陷型； 易于转化/ 转导； 易筛选 遗传稳定性高，易于扩大培养； 安全性高； 内源蛋白酶基因缺失或缺陷； 遗传密码无明显偏好性； 具有较好的转译加工机制； 较高的理论和实践应用价值。
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 1
第五章 目的基因导入和重组子的筛选
5.1 DNA片段的连接重组
5.2 受体细胞选择的基本原则
5.3 基因转移
5.4 重组子的筛选
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 2
5.1 DNA片段的连接重组
5.1.1 DNA连接类型 5.1.2 DNA片段之间连接的方式 5.1.3 DNA重组中需注意的问题
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 23
• 体外装配（in vitro packaging）：λ DNA的转染 效率不高，如果将重组的λ分子装配成头-尾结 构的病毒粒子，将极大的提高效率。
5/11/2015 8:30 AM
欢迎同学们听课！
Slide 24
噬菌体转化大肠杆菌的方法
欢迎同学们听课！
5/11/2015 8:30 AM
Slide 10
5.3 基因转移（gene transfer）
• 载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分 子： a. 未连接的载体分子 b. 未连接的DNA片段 c. 载体的自连 d. 含有错误插入片段的重组DNA分子 e. 重组DNA分子 转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细 胞内。未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特 殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片 段。自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入
(2) 载体上有两个不同的酶识别位点
定向置换
5/11/2015 8:30 AM 欢迎同学们听课！
Slide 5
5.1.2 DNA片段之间连接的方式 • 具互补黏性末端片段之间的连接
• 具平末端DNA片段之间的连接
• DNA片段末端修饰后进行的连接
• DNA片段加linker or adaptor后的连接