动物血液原虫病病原检查技术

动物血液原虫病病原检查技术

一、实验目的要求

掌握动物血液原虫病的血液涂片技术和染色方法；正确判断各种常见血液原虫的形态特点。

二、实验器材

（一）仪器设备生物显微镜（带油镜镜头）、载玻片、注射针头、剪刀、染色缸

（二）试剂姬姆萨氏染料、甘油、甲醇、香柏油

（三）实验动物鸡

（四）示教标本

1．伊氏锥虫

2．双芽巴贝斯虫

3．环形泰勒虫

4．卡氏住白细胞虫

5．沙氏住白细胞虫

三、实验方法、步骤和操作要领

（一）姬姆萨氏染色液的配制

1．姬姆萨氏染色液原液配方。

姬姆萨氏染色粉 0.5g

中性纯甘油 25ml

无水中性甲醇 25ml

2．姬姆萨氏染色液原液配制过程。

（1）先将姬姆萨氏染色粉置研钵中，加少量甘油充分研磨，再加甘油再研磨，直至甘油全部加完为止。将其倒入棕色小口试剂瓶中，在研钵中加入少量甲醇以冲洗甘油染液，冲洗液仍倒入上述瓶中，再加甲醇再洗再倒入，直至25 ml甲醇全部用完为止。

（2）塞紧瓶盖，充分摇匀，而后将瓶置于65℃温箱中24h或室温3～5d，并不时摇动，然后过滤到棕色小口试剂瓶中，即为原液。

（二）血液涂片的制作及染色

1．血液涂片的制作。

（1）薄片法（适合于观察红细胞内虫体，如巴贝斯虫）。

①用消毒注射针头刺破鸡的翅下静脉。

②用洁净载玻片的一端，从鸡的翅下静脉穿刺处接触血滴表面，蘸取少量血液。

③另取一块边缘光滑的载玻片，作为推片。先将此推片的一端置于血滴的前方，然后稍向后移，触及血滴，使血液均匀分布于两玻片之间，形成一线。

④推片载玻片与血片载玻片成30～45°角，平稳地向前推进，使血液接触面散布均匀，即成薄的血片。

⑤抹片完成后，立即置流动空气中干燥，以防血球皱缩或破裂，并加甲醇固定，待干。

（2）厚滴法（适合于观察血浆内虫体，如伊氏锥虫）。

①取血液1～2滴置洁净载玻片上。

②用另一块载玻片之角，将血滴涂散至直径1cm即可。

③置室温中待其自行干燥(至少经1h之久，否则血膜附着不牢，染色时易脱)。

④染色前先将血片置于蒸馏水中，使红细胞溶解，血红蛋白脱落，血膜呈灰白色为止，再进行染色。

2．血液涂片的染色过程。

（1）血片用甲醇固定2 min。

（2）将血片浸于用10份蒸馏水加1份染液稀释的染色液缸中30 min (过夜最好)。或将蒸馏水与染液按2∶1稀释好的染色液直接滴加于血片上，染色10 min 。

（3）血片取出后，用洁净的水冲洗。待干镜检。

附：血液涂片的制作及染色流程图。（图16-1）

图16-1 血液抹片的制作及染色流程图

四、实验注意事项

1．配制染色液时姬姆萨氏染料必须充分研磨。

2．采血前先用酒精棉消毒待干，以免皮屑污染血片和酒精溶血。

3．取血滴时必须在针头刺破后流出的表层血液用玻片迅速蘸取，以免血液凝固。

4．注意在病畜出现高温期，未作药物处理前采血，以提高虫体检出率。

5．涂片时血膜不宜过厚，使红细胞均匀分布于玻片上。

6．血片必须充分干燥后再用甲醇固定，以免血膜脱落。

五、实验报告

如何制作染色效果好且无杂质污染的血液涂片？试作分析、阐述。

附：参考资料

1．家畜常见血液原虫的形态特征描述。

（1）伊氏锥虫。伊氏锥虫寄生于动物血浆内，虫体呈纺锤或柳叶状，体长18～24µm，宽1～2µm。前端比后端更尖。经姬姆萨染色后，虫体呈淡蓝色。在显微镜下可看见下列几部分构造：①原生质：浅蓝色部分。②核：在虫体中部呈紫红色椭圆形。③副基体：在虫体后端呈紫红色的小圆点。④波动膜：在虫体的一侧呈波状。⑤鞭毛：在虫体后端，从付基体附近的毛基体开始围绕波动膜边缘，直到虫体的前端游离，呈细长鞭毛状。（图16-2、图16-3）

（2）双芽巴贝斯虫。双芽巴贝斯虫寄生在红细胞内。虫体较大，有梨形、环形、椭圆形、变形虫形等。典型虫体呈双梨形，细的一端联在一起成锐角排列。虫体大于红细胞半径，经姬姆萨染色后，原生质浅蓝色，边缘较深，有二团紫红色的染色质。（图16-4）

图16-2 锥虫模式图

1.核

2.波动膜

3.副基体

4.生毛体

5.颗粒

6.空泡

7.鞭毛

图16-3 血液涂片中的锥虫

（3）环形泰勒虫。环形泰勒虫寄生在牛的淋巴细胞、巨噬细胞及红细胞内。

配子体呈小环形，短棒状或逗点状。在每个红细胞中通常有1～5个虫体，大小为0.7～2.9µm，染色后原生质呈浅蓝色，染色质呈紫红色。（图16-5）

裂殖体，又称石榴体，有不同形状和大小，存在于淋细胞的胞浆中或淋巴液中。通常可看到浅蓝色的原生质背景上有暗紫色数目不等的染色质核。（图16-6）

2．家禽常见血液原虫的形态特征描述。

（1）卡氏住白细胞虫。卡氏住白细胞虫配子体寄生在鸡的血细胞内。

配子体刚侵入红细胞时呈圆点状或逗点，每个红细胞内可有1～3虫体（图16-7）。随着虫体的发育长大，红细胞的胞浆及胞核萎缩消失，配子体变为近圆形，大小为15.5×15.0μｍ；有一紫红色的核仁（图16-8）。

图16-4 血液涂片中的双芽巴贝斯虫

图16-5 泰勒虫配子体图16-6 泰勒虫裂殖体（石榴体）

（2）沙氏住白细胞虫。沙氏住白细胞虫配子体寄生在鸡的血细胞内。虫体常把红细胞的核推至一边，引起红细胞严重变形，呈梭状或纺锤形。（图16-9）

图16-7 卡氏住白细胞虫第Ⅰ期配子体

图16-8 卡氏住白细胞虫第Ⅴ期配子体

图16-9 沙氏住白细胞虫配子体