生物分析 圆二色光谱

圆二色光谱分析法

引言

五十年代初，生物学研究从宏观领域深入到微观领域，开创了分子生物学的新时代。随着研究的不断深入和发展，生物学已发展成最活跃的学科之一。

手性(Chirality)是物质结构中的重要特征．即具有不能重叠的三维镜像对映异构体，它们的分子式完全相同，但其中原子或原子基团在空间的配置不同，互为镜像。凡手性分子都具有光学活性，即可使偏振光的振动面发生旋转。生物基础分子一般都具有手性，也都具有光学活性。在自然界中，氨基酸有L型和D型两种对映异构体，组成蛋白质的20种氨基酸，除最简单的甘氨酸不具有手性外，其余都是L型的[1]。

手性分子都具有光学活性。当单色左旋与右旋的圆偏振光通过某一种手性样品时，该样品对左、右旋圆偏振光的吸收不同，这叫做圆二色性(Circular Dichroism)。其差值△A=△A L-△A R称为圆二色值，按波长扫描就得到了圆二色谱(CD谱)。CD谱是特殊的吸收谱，它比一般的吸收谱弱几个量级，但由于它对分子结构

十分敏感，因此近十几年来，CD已成为研究分子构型(象)和分子间相互作用的最重要的光谱实验之一。利用CD研究生物大分子和药物分子，具有重要的科学意义和实用价值[2,3]。

一、蛋白质的圆二色性

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质一般有一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次[4-6]。在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。圆二色性的大小常用摩尔消光系数差△ (M-1 ·cm-1 )来度量。蛋白质的CD光谱一般分为两个波长范围，即178—250 nm为远紫外区CD

光谱，250—320 nm为近紫外区CD光谱, 具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。近紫外CD光谱的测量与远紫外CD测量相似，但近紫外CD光谱测量所需蛋白质溶液的浓度一般比远紫外CD测量高1～2个数量级，其测量可在1 cm的方形石英池中进行。

由于CD是一种定量的、灵敏的光谱技术。所以，样品的准备及测量条件的选择对分析计算蛋白质构象的准确性至关重要，一般测试用的蛋白质样品中应避免含有光吸收的杂质，缓冲剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查，透明性极好的磷酸盐可用作为缓冲体系。CD光谱的测量一般在蛋白质含量相对低(0.0l-0.2

g/L)的稀溶液中进行，溶液最大的吸收不超过2。稀溶液可减少蛋白质分子间的聚集。但如果太稀，则导致蛋白质过多地吸附在容器壁上，影响实验的准确性。

二、远紫外CD分析蛋白质二级结构

远紫外CD分析蛋白质二级结构的方法，主要是运用计算机采用一定的拟合算法对CD数据进行加工处理，进而解析蛋白质二级结构。远紫外区CD光谱主要反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。单一波长常用于测定蛋白质或多肽由动力学或热力学引起的二级结构的变化。α-螺旋结构在208及222nm有特征吸收峰，可以利用这两处的摩尔椭圆度[ θ]208或[θ]222来简单估计α-螺旋的含量[7]。参考蛋白是拟合未知蛋白质远紫外CD二级结构的参考标准，参考蛋白的选取将影响CD拟合结果。

随着光学技术发展及同步加速器辐射圆二色(SRCD)光谱技术的发展，远紫外测量光谱可以拓宽到190nm以下的真空远紫外区。由于这一CD光谱区域内，包含着更为丰富的蛋白质二级结构信息，这一光谱区域的参考蛋白质的圆二色光谱及拟合运算方法也已成为研究热点。

三、近紫外CD分析蛋白质三级结构

蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区250～320nm，表现出CD信号[8]。另外芳香氨基酸残基在远紫外光谱区也有CD信号；二硫键的变化信息反映在整个近紫外CD谱上。实际的近紫外CD光谱形状与大小受蛋白质中芳香氨基酸的种类、所处环境(包括氢键、极性基团及极化率等)及空间位置结构(空间位置小于1nm的基

团形成偶极子，虽然这对CD光谱的贡献不是很明显)的影响。近紫外CD光谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境的扰动，能应用于研究蛋白质三级结构的精细变化。总的来说，在250～280nm之间，由于芳香氨酸残基的侧链的谱峰常因微区特征的不同而改变，不同谱峰之间可能产生重叠。Krell[9] 等研究了来自Streptomyces coelicolor的野生型与突变型dehydroquinase 的远紫外与近紫外CD光谱，结果表明，野生型与突变型dehydroquinase 的远紫外CD光谱几乎没有发生变化，即二级结构没有发生明显变化，而其近紫外CD光谱却发生较为明显的变化，即较之二级结构，突变型dehydroquinase 的三级结构可能发生了较为明显变化。

结语

综上所述，圆二色是研究溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法，远紫外CD数据能快速地计算出溶液中蛋白质的二级结构；近紫外CD光谱可灵敏地反映出芳香氨基酸残基、二硫键的微环境变化，蕴含着丰富的蛋白质三级结构信息。另外，CD光谱还能结合紫外、荧光等分析手段，了解蛋白质配体的相互作用，监测蛋白质分子在外界条件诱导下发生的构象变化，探讨蛋白质折叠、失活过程中的热力学与动力学等多方面的研究[10-12]。随着CD光谱技术的进一步发展，它必将在蛋白质研究领域中发挥重要的作用。

文献参考

1Bonner W A．Origins of Life and Evolution of the Biosphere．1991．21, 59．2Sutherland J C et at．"Synchrotron Radiation Sources for Photobiology and Ultraviolet，Visible and Infrared Spec-troscopy in”Trends in Photobio logy”.

Pienum Publishing Corporation．1982．

3Sutherland J C et al．Nucl ．Instr．and Meth. , 1982，l95：375．

4 Yan Longfei(阎隆飞)，Sun Zhirong(孙之荣)．Molecular Structure of Protein(蛋白质分子结构)．Beijing(北京)：Tginghua University Press(清华大学出版社),