“创新实验”顺铂和阿霉素的浓度对细胞增殖产生的影响

创新实验论文

探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响

姓名：胡尔曼那力·艾力胡加

学号：201111202924

年级：2011级

专业：生物科学

探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa细胞增殖和凋亡产生的影响

摘要：本实验主要探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素对HeLa细胞增殖及凋亡的影响，HeLa细胞是一种癌细胞，增殖速度快，通过探究其药物的浓度对癌细胞的抑制及其凋亡情况，可以利用药物有效地控制细胞的增殖并使细胞致死。通过MTT比色法对HeLa细胞进行生长曲线的测定，观察细胞的生长情况。在生长曲线上找出相应的IC50的值，并且比较不同浓度下的IC50的值，即可知道药物的浓度对细胞增殖所造成的影响。通过流式细胞术实验方法测出细胞的凋亡比例及各个周期时相的百分比即可知道不同药物对于HeLa细胞凋亡的影响。

前言：细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以细胞分裂的方式进行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞如果增殖异常如无限地增殖，将会导致生物体的正常生命功

能受阻，如肿瘤的发生。细胞死亡也是生物体的重要生命活动之一。多细胞生物发育过程中，在细胞增殖和分化的同时一些细胞被选择性地消除，以形成组织、器官和四肢，而且在整个生命进程中，细胞的死亡与新细胞的产生之间的动态平衡对于维持组织和器官的正常功能具有重要作用。因此，细胞死亡调控的异常与帕金森症、自身免疫性疾和癌症等疾病的发生和发展密切相关。

癌症是威胁人类健康的最严重的疾病之一，并呈不断上升趋势。目前用于癌症治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗。肿瘤化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗肿瘤的方法。不同肿瘤的化疗效果差别很大，手术前后的合理化疗，有助于提高疗效。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用。其中很多抗肿瘤药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小。如顺铂、阿霉素、喜树碱、顺铂、阿糖胞苷、放线菌酮、环磷酰胺。这些药物均可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且目前有不错的效果。

关键词：顺铂阿霉素HeLa细胞细胞增殖细胞凋亡

1 实验原理

1.1 HeLa细胞

HeLa细胞是源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞。HeLa细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒（Human Papillomavirus 18 或HPV18）转型成癌细胞的HeLa细胞至今已被视为“不死的”，也就是说此细胞株（不同于其他人类细胞）不会老死，而且可以不限次数的分裂下去，而且已培养出一个不间断的系列。从1951年至今，HeLa细胞已经培养了50多年，分裂了18000

次以上仍然没有停止的迹象。此细胞株即使和其他癌细胞相比，增殖依然异常迅速。

1.2顺铂和阿霉素

顺铂（顺氯氨铂，cisplatin,DDP）

将所含之氯解离，然后与DNA上的核碱鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成DNA 单链内两点的交叉联结，也可能形成双链间的交叉联结，从而破坏DNA的结构和功能。对RNA和蛋白质合品属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用。临床用于卵巢癌、癌前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。

成的抑制作用较弱。属周期非特异性药物。

阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成来杀灭癌细胞。盐酸阿霉素对机体产生广泛的生物化学效应。具有强烈的细胞毒性作用。其作用机制主要是阿霉分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。

1.3 PI和Ho.33342

PI（碘化丙啶）：双链核酸标记物，亲水性，不能通过完整细胞膜，激发光谱和发射光谱分别为535nm和617nm，激发光波长范围较宽，从紫光到绿光均可作为激发光。

Ho.33342：特异结合AT区的DNA标记物，亲脂性，激发光谱和发射光谱分别

为350nm和461nm

细胞类型膜完整性染色质凝集程

度凋亡小体的形

成

PI染色Ho.33342

正常细胞完整不凝集无无法透过蓝色

凋亡细胞完整高度凝集有无法透过蓝色

坏死细胞破损一定程度的凝

集无橘红色蓝色（同时染PI

被橘红色遮掩）

1.4 MTT比色法

MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

1.5 IC50

IC

50

是指细胞被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应，抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。

2 .实验步骤

2.1 利用MTT法检测细胞增殖

1、取对数生长期的细胞,用胰酶消化计数,配制细胞悬液浓度为4x104/mL，取细胞接种到96孔板，每孔200μL，8000细胞/孔。

2 、加药处理:

•（1）24小时后，待细胞贴壁后吸取培养基200μL，弃除，调零孔不作处理。

•（2）设置药物浓度分别为1x10-3μg/μL、2x10-3μg/μL、4x10-3μg/μL、6x10-3μg/μL、8x10-3μg/μL,对应按每列分别加入Cc1、C2、C4、C6、C8(顺铂组)，Cd1、D2、D4、D6、D8（阿霉素组）列中。96孔板上药