影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

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巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

达系统。具有比哺乳动物细胞易于进行遗传操这主要归功于毕赤酵母具有的其他表达系统不可
比拟的优点：具有目前最强，调控机理最严格的启动子一醇氧化酶ＡＸＯ１基因启动子，格调控外严
缺乏转录后加工修饰的缺陷，弥补酿酒酵母缺乏
系统的起源、物学特性、合蛋白的表达以及影响蛋白表达量的因素。生融
关键词毕赤酵母；物学特性；白表达生蛋
中图分类号Ｔ９６Ｑ２文献标识码Ａ文章编号１０７２（０７００７００５－０１２０）６— ０２— ５
ＡｄａｃｎｔｅＲｅｅｒｈｏｒｉｎＰｒｔｉｐｒｓｉｎｏｃｉｓｏｖｎｅｉｈｓａｃｆＦｏｅｇｏｅｎＥｘｅｓｏｆＰｉｈａｐａｔｒ
ＬＧｉｇＯＮＪｎ，ＤＵＬ－ｉｉｎｘ
物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、叠、硫折二
ｔｉａｅ，ｔｅａｖｎｃｎｏｉｉｈｓｐｐｒｈｄａｅｉｒｇｎ，ｂｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｃ，ｆｓｏｒｔｉｘｒｓｉｎｏｈｅｓｓｅａｎｈｅａｓｃａｅｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｉｓｕｉｎｐｏｅｎｅｐｅｓｏｆｔｙｔｍｄｔｓｏｉｔｄ
密度发酵，源蛋白表达量高；在过氧化物酶外存
工，赤酵母表达系统在国内外已经引起了高毕度重视，２０到０５年止，经有５０多种蛋白在该已０系统中进行了表达。

巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用

Байду номын сангаас
&’()1!、 &’()1!2 和 &’()1!) 等；分泌表达的载体有 0% 、 &’()3 、 &’()3+、 &!)"45- 、 &’()1!!、 &’()1!2 、 &’()1!) 和 &$(.
有一个外源基因 /65 等。通用的整合载体多含有 ! "#$ 启动子，和一个从 ! "#$ 基因上拷贝下来的终表达框、多克隆位点（ %&’ ），作为筛选标记的 ()*+ 基因和在细菌中进行复制起止序列（ 77）始点和选择标记（如 )89:5 复制起始点和抗氨苄青霉素基因）以使外源基因能以同源重组的方式整及 ! "#$ *;的非编码区序列，合到染色体的 ! "#$ 部位（表 5）。
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毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

毕赤酵母高效表达策略-1

1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。

尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。

A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。

因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。

（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。

外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。

2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。

PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。

（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。

（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。

外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测-精选文档

水平低于100 mg/L的基因。
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使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。使用Tclass程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高低的6个区间组合。
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我们将40例数据按75％的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数，如此重复1,000次，这样我们得到了1,000个判别函数，如第一个判别函数为： HEG1=－20.20203＋0.52552X1－2.35843X2＋1.53122X3－2.24870X4－1.19898X5＋ 1.53908X6 (1)
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pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
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表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的两种方式：
1. 载体的3' AOX1区与基因组的
AOX1基因的末端发生整合重组
LEG1=－14.37028＋0.00749X1－0.04135X2－0.87256X3＋2.02204X4＋0.15215X5 － 0.74495X6 (2)
这里的X1, X2, X3, X4, X5 和X6分别代表区间[18,123]，[31,140]，[35,150]，[90,118]， [90,151]和[95,135]的用RNAfold软件计算的最低自由能（计算温度参数设为30℃）。
综合性设计性实验-2
外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定

毕赤酵母外源基因表达系统研究进展

（ＣｌｇｏｌｅｆＨｏｔｕｔｒｈｎｏｇＡｒｃｌｕｅＵｎｖｒｉｅｏｒｉｌｕｅＳａｄｎｇｉｕｔｒｉｅｓｙ，Ｔｉｎ２１１；ｃｔａａ７０８２］ｔｎｌｉａｎｌｎａａｔｎｎｔｕｅ￣ｊｎ００９ｘｉａｍｌｄＰａｔＱｕｒｎｉｅＩｓｔｔ，ｌｉｇ１０２）ａｏＡｎａｉ
Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｐｉｈａｐｓｒｓｈｒｒｌｇｕｅｅｅｐｅｓｏｙｔｍａｅｎｕｉｚｄｔｒｄｃｔｒｃｉｅｌｖｌｆａｃｉａｔｉｅｅｏｏｏｓｇｎｘｒｓｉｎｓｓｅｈｓｂｅｔｉｅｏｐｏｕｅａｔａｔｅｓｖ — ｏｌｖｅｏａｒｔｆｉｔａｅｌｌｒａｄｅｔａｅｌｌｒｐｏｅｎｆｉｔｒｓ，ＩｌｂｍｐｏｅｒｄｌｏｔｎｄａｔｇｖｒｉｙｏｎｒｃｌａｎｘｒｃｌａｒｔｉｓｏｎｅｅｔｔｗｉｅｅｌｙｍｏｅｗｅｙｆｒｉｍａｙａｖｎａｅｏｅｅｕｕｌｄｉｓｓＳｃｈｒｍｙｅｅｅｉｉｅｔｎ￣ｔｒｒｅｃｉｅｅｅａｃａｏｃｓｃｒｓｖａ．Ｉｓｍａｙｆｕｅａｅｄｓｒｄｈｒ．Ｔｈｅｆａｕｅｃｕｅｈｏｔｓｒｉ．ｔｅｅｐｅｓｎｓｂｓｅｅｔｒｉｌｄ：ｔｅｈｓｔａｎｓｎｓｈｘｒｓｉｏｖｃｏｓｈｒｎｆｒａｉｎｍｅｈｓｎｈｔｇａｉｎｏｈｔｒｔｇｎｔｅｇｎｍｅｏ．ａｔｒｓｈｌｍｓ — ｅｔｒ，ｔｅｔａｏｍｔｔｏ，ａｄｔｅｉｅｒｔｆｅｉｅｅｅｅｉｏｔｅｏｆＰｐｓｉ，ｔｅｇｙｙｓｏｄｎｏｔｎｓｎｈｏｌｔｎｏｈｅｅｏｏｏｓｐｏｅｎａｄｈｇａｉｆｔｅｈｔｒｌｇｕｒｔｉｎｉｈ—ｄｎｉｅｍｅｔｔｎａｄｏｈｒ．ｏｅｓｔｆｙｒｎａｉｎｔｅｓｏＫｅｒｓＭｅｈｌｔｏｈｃｙａｔＰｉｈａｐｓｒｓＥｘｒｓｉｎｓｓｅｙｗｏｄ：ｔｙｏｒｐｉｅｓｓｃｉａｔｉｏａＰａｔｒｓＨｅｅｏｏｏｓＧｅｅＥｘｒｓｉｎＳｓｅａｅｎｔｅＰｉｈｉｓｏｉｒｒｌｇｕｎｐｅｓｏｙｔｍ

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量，必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。

影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。

本文就这些因素进行分析，并提出一定的对策和建议。

酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。

几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。

已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。

另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。

所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。

1、外源基因特性外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。

不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。

Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。

另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。

提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。

因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。

而Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。

介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。

关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。

2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。

绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。

后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述

毕赤酵母发酵工艺对产量的影响

甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白

表达效率高，外源蛋白分泌高，产物易于纯化
毕赤酵母的缺点

发酵周期长，甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性。

产物蛋白质可能出现不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。时常遇到表达产物的过度糖基化情况

重组毕赤酵母的表型
毕赤酵母工程菌株有Y11430，MG1003，GS115 （AOX1）， KM71，SMD1168 根据利用甲醇的能力 , 可将巴斯德毕赤酵母分成三型 Mut+ ：毕赤酵母具有完整的AOX1 和 AOX2 基因 , 能够在甲醇中以野生型速率生长 , 为甲醇快利用型如GS115 , 绝大多数毕赤酵母为 Mut+表型。 Muts ：此型毕赤酵母 , 如 KM71的 AOX1 基因部分敲除 ,被酿酒酵母ARG4 基因所取代 , 菌细胞可依赖 AOX2基因编码的少量醇氧化酶完成甲醇代谢 , 因此在甲醇培养基中生长缓慢 , 胞内表达尽量选择muts。即 Mut-型 , 此型毕赤酵母 AOX1 及 AOX2 基因均被敲除 ,菌细胞不能进行甲醇代谢 , 无法在甲醇中生长 ,为甲醇不利用型。

重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

重组人血清白蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要人血清白蛋白是一种在医学上应用广泛，需求量大的蛋白质药物。

而目前血浆提取生产的方式难以满足市场的要求，用基因工程方法生产人血清白蛋白无疑具有巨大的商业价值。

由于巴斯德毕赤酵母表达系统自身的许多优点，使得其在表达外源蛋白中具有十分大的优势。

本文的工作是用巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）构建并筛选分泌重组人血清白蛋白(rHSA)基因工程高产菌株，并对其发酵纯化条件进行初步研究。

在构建高产人血清白蛋白的基因工程菌时，采用了分泌型表达质粒pPIC9K构建成质粒pPIC9K-hsa。

构建的质粒经线性化后电转化整合进入毕赤酵母GS115染色体AOX1基因中，通过MD/MM平板筛选出his+Mut s型菌株。

在此基础上，用G418平板筛选出高拷贝表达子。

BMGY/BMMY摇瓶培养对不同的拷贝子进行筛选，发现随着拷贝子的增加表达量增加。

其中菌株GS115-rHSA-8表达量最高。

免疫印迹检测所表达的rHSA具有免疫原性。

采用工业基础盐培养基，用摇瓶对发酵条件进行了实验研究。

结果表明，组氨酸的加入量为0.15g/L时，蛋白表达量增加57.1%；加入0.10%体积比油酸时，蛋白量可增加43.4%；甲醇浓度控制在0.5％体积比左右时可以获得高产量，甲醇的加量超过1%体积比时，会对蛋白的分泌表达产生抑制，在2%时已经比较明显；甲醇诱导时添加甘油时可以提高产量，但当甘油添加量达到0.2%体积比时甘油已产生抑制表达作用；诱导表达时硫酸铵浓度为7g/L时蛋白浓度最高，高于9g/L时已开始出现抑制表达作用；改变培养时发酵液的pH为7.0，诱导表达时添加 1.5%的YP(Yeast extract,5g/L; Peptone, 10g/L)均可以有效的控制rHSA的降解，而温度对蛋白的降解没有显著性影响。

另外，添加100μm的PMSF也对降解有较好的控制作用，但因为毒性原因其安全性值得评价。

巴斯德毕赤酵母生物过程

巴斯德毕赤酵母生物过程
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种广泛用于重组蛋白生产的生物表达系统。

巴斯德毕赤酵母的生物过程涉及以下几个关键步骤：
1. 基因插入：通过同源重组将目标基因插入到巴斯德毕赤酵母的基因组中，通常插入到甲醇氧化酶（AOX1）基因的位置，利用其强启动子来实现高效表达。

2. 蛋白质表达：在甲醇的存在下，巴斯德毕赤酵母会被诱导产生大量的重组蛋白。

甲醇氧化酶是巴斯德毕赤酵母代谢甲醇的关键酶，其在细胞中的含量会随着甲醇的加入而显著增加，从而带动目标蛋白的表达。

3. 蛋白质折叠和修饰：巴斯德毕赤酵母具有真核生物的翻译后修饰能力，包括糖基化、二硫键形成等，这对于许多蛋白质的功能至关重要。

4. 蛋白质分泌：巴斯德毕赤酵母能够将重组蛋白分泌到培养基中，这有助于简化后续的纯化过程。

由于其内源分泌蛋白的产生有限，重组蛋白的纯化相对容易。

5. 过程优化：为了实现目标蛋白质的最大产量，需要对培养条件进行优化，包括甲醇和山梨糖醇的浓度、菌株的形式（Mut表型）、温度和孵育时间等因素的调整。

巴斯德毕赤酵母作为一种高效的表达系统，不仅操作简便，而且能够提供适当的蛋白质折叠和翻译后修饰，使其成为生产重组蛋白的理想选择。

浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究

３Ｘ１＇ＡＯ终止序列，筛选标记等等【。】３巴斯德毕赤酵母的表达蛋白质的塘基化
该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以去除
的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原
【２杨维仁，姜淑贞，杨在宾等．胃投饲不同形式蛋氨酸对肉牛营养ｌ】瘤
山东
２１第３００年ｌ
浅析巴斯德毕赤酵母表达系统的研究
王艳（山东省枣庄市畜牧兽医局
中图分类号：Ｔ９０１Ｑ２．文献标识码：Ｃ
２７０）７８０
文章编号：１０ —７３２１）００８．２０７１３（００１．０６０
物质消化率和血液指标的影响明．畜牧兽医学报，０４３（）１０１６２０，５２：６．６．０３】ＷｈｔＣＬＴｂＤｖ，ｅａＩｃｅｓｆｃｎｙｏｏｉ，ａｅＬＭ，ｏｅｔ１ｎｒａｅｅｉｃｆｗｏｌｅ．ｉｅ
ｇｏｔｎｉｅｗｅｇｔｇｉｎｍｅｉｏｓｅｐｆｄｆｎｇｎｃｌｐｅｄｒｗｈａｄｌｉｈａｎｉｒｎｈｅｅａｓｅｉｕｉｓｅｖｎ
泌性的外源蛋白占所有被分泌蛋白的３％以上，容易分Ｏ
１巴斯德毕赤酵￣（ｉｉＰｓｒ）：ｃａａｔｉ表达系统的特点Ｐｈｏｓ
巴斯德毕赤酵母是近年来兴起的一个真核高效表达
系统，具有许多独特的优点，已迅速发展成为分子生物

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。

近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。

越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。

P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。

但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。

胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。

胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。

根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）。

表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathwayEnzyme Type Gene Zymogen formVacuole PrA Aspartic PEP4 YesPrB Serine PRB1 YesCpY Serine PRC1 YesCpS Metallo-( Zn2+) CPS1 UnknownApI Metallo-( Zn2+) LAP4 YesApCo Metallo-(Co2+) DAP2 NoDPAP-B Serine SEC11 UnknownSecretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown,predict noYeast as partyl protease ш Aspartic Y AP3 Unknown,predict yes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解。

巴斯德毕赤酵母(P pastoris)表达系统

巴斯德毕赤酵母(P pastoris)表达系统
邹运明;李一经;邹丽红
【期刊名称】《黑龙江畜牧兽医》
【年(卷),期】2004()11
【摘要】近年来，基因工程菌被广泛用于商业化生产外源蛋白。

原核生物作为基
因工程表达系统简单而易培养，有其一定的优点，但也存在着一定的缺陷，如不能对表达蛋白进行糖基化等翻译后修饰，特别是对核基因的表达，可能导致产物失去生活活性。

自1981年Hitzeman等首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后，相继又有多种外源基因表达成功。

与大肠杆菌不同的是，酵母可对异源蛋白进行修饰，采用有信号肽的质粒时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中；【总页数】2页(P70-71)
【关键词】马斯德毕赤酵母表达系统;基因工程;宿主菌;载体类型;外源蛋白修饰
【作者】邹运明;李一经;邹丽红
【作者单位】东北农业大学动物医学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展 [J], 李杨;蔡海莺;赵敏洁;李阳;冯凤琴
2.巴斯德毕赤酵母表达系统表达重组蛋白的影响因素及优化 [J], 韩彦锋;冷希岗
3.巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高密度发酵研究进展 [J], 闵兆升;郭会明;颜旭;洪厚胜
4.巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展 [J], 罗竞红;游自立
5.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统及其在外源蛋白生产中的优势与应用前景 [J], 马兴元;谭建华;朱平;孙曼霁
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毕赤酵母表达系统简介

巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。

以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。

作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。

表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。

它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。

含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。

1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。

毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策

2 毕赤酵母表达载体的优越性
酵母作为一种最简单的单细胞真核生物 , 兼有原核生物和真核生物的某些优点。毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同 , 从而节省了重新购置设备和进行新技术探索的巨额花费 , 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。现将毕赤酵母表达系统优点概括如下 : ①毕赤酵母更接近高等真核细胞 , 不含内毒素和其他有害物质 , 使用安全 ; ②同酿酒酵母一样 , 繁殖速度快 , 对培养条件要求低 , 培养基价廉 , 能进行高密度培养 , 且能耐受较高的液体静压 , 便于工业化生产 ;
413 载体类型整合型载体虽然稳定性高 , 但是基因的拷贝数量低。虽然
单拷贝表达单元就足以达到最佳的生产水平 , 但在有些实例中 , 多拷贝数表达单元对高效表达可产生令人满意的结果。构建含多拷贝外源基因表达盒的 P1pastoris菌株的方法有 : ①通过 SDS2PAGE、免疫印迹、菌株斑点杂交、不断提高抗生素浓度的方法得到转化菌中仅占百分之几的天然存在的多拷贝菌株 ; ②将多拷贝表达盒插入到载体质粒中进行转化 , 或者将目的基因的 DNA片段在体外连接成串联体后再转化酵母菌 ; ③ 现在又建立了一种新的方法 : 多重转化筛选法。无论天然形成 , 还是转化前人为构建的多拷贝基因 , 在酵母生长、繁殖及发酵罐生产的压力下均可稳定存在。但是在一些很少的实例中 , 增加拷贝数对蛋白质的表达产量反而会有副作用。所以应根据实际检测的蛋白质的表达量来作为判断的有力依据。 414 目的蛋白
畜牧与兽医 2007年第 39卷第 2期
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毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策