细胞自噬预实验

细胞自噬预实验

化学染色法

1、试验目的

通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。

2、试验原理

3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。

3、试验材料及试剂

HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、

0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片

AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。

4、试验方法

1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物

处理48h。

2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。

4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀

6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片

7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。