细胞自噬预实验
碧云天细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)说明书
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)产品简介：碧云天生产的细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC ，是一种使用丹酰尸胺，也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。
自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。
自噬与多种生理功能有关，在饥饿等环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。
自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。
由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个研究热点。
MDC 是细胞自噬检测最常用的荧光探针之一。
MDC 可以通过离子捕获(ion trapping)和与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬体(autophagosome)，也称autophagic vacuole ，因而常用于细胞自噬的检测。
MDC 是一种嗜酸性荧光探针，很多酸性膜性结构也会被MDC 染色，因此MDC 染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。
本产品的染色原理决定了本产品只能用于培养的细胞或者组织的细胞自噬荧光染色检测，不能用于冻存的或固定的细胞、组织或者组织切片的染色检测。
使用本产品染色后可以通过荧光显微镜拍照观察，也可以通过荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光检测。
荧光显微镜观察时可以使用紫外区激发光激发，发出绿色荧光。
荧光酶标仪或流式细胞仪推荐的激发波长为335nm (330-360nm 均可)，发射波长为512nm (510-540nm 均可)。
本产品用于细胞自噬染色的效果参考图1。
图1. 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)的染色效果图。
自噬监测——LC3双标腺病毒(完整版)
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南1自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
医学细胞生物学实验
细胞凋亡诱导与检测
细胞凋亡检测
细胞凋亡诱导
自噬诱导
通过饥饿、药物刺激等手段诱导细胞自噬，以研究自噬的生物学意义和作用机制。
自噬检测
采用荧光染色、电镜观察、蛋白质印迹等方法检测自噬体的形成、数量和相关蛋白的表达。
自噬诱导与检测
03
02
01
实验原理
实验设计
根据实验目的和原理，设计具体的实验方案和操作流程。
实验操作
按照实验方案进行实验操作，包括细胞培养、显微观察、分子生物学检测等步骤。
数据收集与分析
收集实验数据，进行统计分析，得出实验结果。
结果汇报与讨论
将实验结果以书面形式汇报，并进行讨论和总结。
实验步骤
02
细胞培养
CHAPTER
利用免疫荧光染色、荧光共振能量转移等技术，可以检测和定位细胞内特定信号分子的分布和动态变化，进而揭示其在信号转导中的作用机制。
详细描述
总结词
信号转导抑制剂的应用
总结词：信号转导抑制剂是一类能够干扰细胞信号转导过程的化合物，具有潜在的治疗作用。
07
细胞凋亡与自噬研究
CHAPTER
通过使用化学物质、射线、病毒等手段诱导细胞凋亡，以研究其发生机制和生物学意义。
电子显微镜
利用电子束代替可见光，观察细胞超微结构。
显微镜观察
通过显微镜或细胞计数板，统计细胞数量。
细胞计数
利用染色剂或荧光染料，检测细胞活性，如MTT法、染色排除法等。
细胞活力检测
细胞计数与活力检测
利用染色剂对细胞进行染色，以便观察细胞形态和结构。
染色技术
自噬研究方法
MDC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。
临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;Rapamycin:用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积<0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;3-MA:首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L; PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。
文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 hsigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。
EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。
另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。
24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。
我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。
线粒体自噬操作指南
线粒体自噬操作指南汉恒生物科技（上海）有限公司目录背景 (1)一、汉恒线粒体自噬表型研究工具 (1)二、汉恒线粒体自噬通路研究工具 (2)⏹病毒安全使用注意事项 (3)⏹收到病毒后的处理 (3)腺病毒的操作 (5)⏹腺病毒感染细胞预实验（MOI的摸索） (5)⏹感染目的细胞 (7)（一）细胞准备 (7)（二）病毒感染 (7)（三）观察感染情况 (8)（四）结果分析 (8)背景自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新线粒体自噬是细胞在应对氧化应激等压力条件下一种基本的生物学现象，细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程。
选择性清除受损伤或功能不完整的线粒体对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。
一、汉恒线粒体自噬表型研究工具我们用自噬小体单标工具LC3-GFP标记自噬小体，用mito-RFP标记线粒体。
GFP-LC3和RFP-LC3等单标记的荧光探针可以监测LC3蛋白参与自噬起始过程。
mito-RFP线粒体特异性定位荧光探针（pHBmTur-Mito）可准确标记定位线粒体，两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。
除此外，我们研发了专用于线粒体自噬的mt-keima，可独立应用于线粒体自噬的研究，mt-keima所表达的 Keima 蛋白定位于线粒体基质, 当线粒体自噬体与酸性溶酶体融合后Keima 蛋白的荧光信号由绿色转为红色，荧光信号的转换可定量反映线粒体自噬的发生发展，是我们研究线粒体自噬不可或缺的利器相关产品列表：产品名称融合标签产品规格HBAD-GFP-LC3GFP1x10^10PFU/mlHBAD-GFP-LC3GFP1x10^11PFU/mlHBAD-mito-dsred Dsred1x10^10PFU/mlHBAD-mito-dsred Dsred1x10^11PFU/mlHBAD-mkeima Keima1x10^10PFU/mlHBAD-mkeima Keima1x10^11PFU/ml备注：汉恒生物同时提供相关基因慢病毒和腺相关病毒包装服务，满足广大科研工作者不同实验需求，如使用慢病毒和腺相关病毒产品，具体操作参考相应技术文档。
自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。
目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP（-RFP）-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。
这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理（一）、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。
（1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；（2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。
2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%）。
建议不要在-20℃下长期保存。
如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。
3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品（购买时请提出）。
自噬流的检测方法
自噬流的检测方法一、本文概述自噬流是一种细胞自我消化和再生的过程，对于维持细胞稳态和适应环境变化具有重要意义。
随着生物学研究的深入，自噬流的检测已成为研究细胞自噬机制的重要手段。
本文旨在综述自噬流的检测方法，包括常用的生物化学方法、显微成像技术以及基于流式细胞仪的分析等。
我们将详细介绍这些方法的原理、操作步骤、优缺点以及应用实例，以期为自噬流研究提供全面的技术支持和参考。
通过本文的阅读，读者可以深入了解自噬流检测的原理和方法，掌握自噬流研究的最新进展，为相关研究提供有益的借鉴和指导。
二、自噬流的基本概念和机制自噬流（Autophagic Flux）是细胞自噬过程的一个核心概念，它描述了从自噬体的形成、自噬底物的降解，到降解产物的再利用这一连续过程。
自噬是一种细胞内的降解途径，通过这一过程，细胞可以将受损的细胞器、错误折叠的蛋白质或其他细胞内组分包裹在双层膜结构的自噬体中，并运送到溶酶体进行降解，从而实现物质的循环利用和细胞的稳态维持。
自噬流的基本机制涉及多个关键步骤。
细胞在感受到饥饿、缺氧或其他压力信号时，会启动自噬过程。
随后，自噬相关基因（Autophagy-related genes, ATGs）及其产物会参与自噬体的形成。
这些自噬体通过膜延伸和闭合，将待降解的底物包裹在内。
形成成熟的自噬体后，它们会与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。
在自噬溶酶体中，自噬体的内膜及其包裹的底物会被溶酶体中的水解酶降解，释放出氨基酸、脂肪酸等小分子物质。
这些降解产物随后会被细胞重新利用，以支持细胞的生存和代谢活动。
自噬流的顺畅进行对于细胞的正常生理功能至关重要。
它不仅可以清除细胞内的有害物质和受损组分，还可以为细胞提供能量和营养物质，以应对各种环境压力。
因此，研究自噬流的检测方法对于理解自噬的生理和病理作用，以及开发相关疾病的治疗策略具有重要意义。
三、自噬流检测方法的分类与特点自噬流的检测是理解自噬过程的关键环节，其方法多种多样，各具特点。
透射电子显微镜观察细胞自噬的具体步骤及详细方法
透射电子显微镜观察细胞自噬的具体步骤及详细方法技术简介透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是使用最为广泛的一类电镜。
通过发射电子束从而穿过超薄的样品，同时与样本相互作用，既而形成图像。
透射电镜具有分辨率高和放大倍数高的优点。
其分辨率为0.1-0.2nm，放大倍数为几万到几十万倍。
目前透射电镜已经广泛的应用到癌症研究，病毒学研究，微生物学，细胞学研究等生物领域。
透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。
电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。
散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。
由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备超薄切片(通常为50-100 nm)。
要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小(1mm3以内)，常用戊二醛和锇酸双重固定，包埋介质包埋，用超薄切片机切成薄片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。
自噬体是自噬的标志性结构。
自噬体属于亚细胞结构，直径一般为300～900nm，平均500nm，普通光镜下看不到。
通过透射电子显微镜发现自噬体一直是观察自噬现象最直接、最经典的方法，是自噬检测的“金标准”。
二、实验流程透射电镜生物样品制备步骤：1. 固定：用2.5%的戊二醛固定2小时。
2. 锇酸固定：用2%的锇酸固定2小时。
3. 脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脱水各15min(70%乙醇中过夜)，再用100%乙醇脱水3次，每次20min。
4. 置换：用丙酮置换2次，每次15min。
5. 浸渍：a．丙酮：包埋剂=1：2的浸渍液浸渍4h；b. 纯包埋剂浸渍2次，每次4h。
6. 包埋：将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中。
7. 聚合：将包埋板置于65℃条件下各聚合48h以上。
8. 修块：将包埋头修成梯形，且样品表面积小于0.2mm×0.2mm。
细胞自噬过程及临床应用展望
细胞自噬过程及临床应用展望细胞自噬（autophagy）是一种重要的细胞生物学过程，通过将细胞内的有害物质、受损蛋白或细胞器包裹进独特的囊泡（自噬体）中，然后通过与溶酶体融合并降解这些物质的方式，实现细胞清除和再利用的过程。
细胞自噬在维持细胞内环境稳定、抗衰老、抗癌以及调节免疫应答等方面发挥着重要作用。
最近的研究进展表明，细胞自噬还具有潜在的临床应用前景，在促进治疗药物的研发以及治疗许多与老年病相关的疾病方面具有潜力。
细胞自噬的过程通常可以分为三个主要步骤：包裹、运输和降解。
首先，通过膜结构的特殊复合物形成，细胞内的有害物质或细胞器被包裹在称为自噬体的囊泡中。
这些自噬体随后被转运至溶酶体，然后与溶酶体膜融合，形成自噬体溶酶体复合体。
最后，在自噬体溶酶体复合体中，有害物质被酶降解并分解成可再利用的基本分子，并通过自噬体溶酶体膜通过逆向运输返回到细胞质中进行再利用。
在细胞自噬的过程中，一些关键分子和信号通路起着重要作用。
微管相关蛋白1A/1B轻链3（microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3, LC3）是自噬过程中重要的标志物，参与了包裹和运输步骤，被广泛用于研究细胞自噬。
自曝7p/cm-镰刀硷赋恁殖勐格揪?降解的最终产物。
另外，以mTOR （mammalian target of rapamycin）为核心的信号通路在细胞自噬的调节中起着重要的作用。
当细胞受到应激或营养不足时，mTOR信号通路会被抑制，从而促进自噬的启动。
细胞自噬在许多疾病的发生发展中发挥着重要作用。
研究发现，细胞自噬在保护细胞免受氧化应激和蛋白质聚集等损伤时具有保护作用，可能在癌症的预防和治疗中发挥着重要作用。
一些化疗药物和免疫治疗手段已经被发现可以通过促进细胞自噬来增强对癌细胞的杀伤作用。
此外，细胞自噬还与多种老年病和神经退行性疾病的发生发展有关。
例如，阿尔茨海默病、帕金森病和亚历山大症等疾病都存在细胞自噬缺陷的现象。
线粒体自噬实验研究步骤
线粒体自噬实验研究步骤一、实验准备1. 实验设备：显微镜、细胞培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备等。
2. 实验试剂：DMEM培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、线粒体自噬相关抗体、荧光标记二抗、细胞凋亡检测试剂盒等。
二、细胞处理1. 细胞传代：将细胞从培养瓶中吹散，加入适量培养基，离心后重新悬浮于培养基中，接种到培养皿或培养瓶中，放入细胞培养箱中进行培养。
2. 细胞同步化：为了使实验结果更加准确，需要对细胞进行同步化处理。
常用的方法包括饥饿法、血清法等。
3. 药物处理：根据实验设计，向细胞中加入相应的药物或抑制剂，处理一定时间后，收集细胞样本进行下一步实验。
三、样本制备1. 细胞爬片：将细胞接种到涂有抗凝剂的载玻片上，培养一定时间后进行固定。
2. 细胞染色：采用荧光染色或免疫组化染色等方法，对细胞进行标记和染色。
3. 制作切片：将染色后的细胞进行切片，制备成临时装片或石蜡切片。
四、显微观察1. 荧光显微镜观察：利用荧光显微镜观察荧光染色标记的细胞样本，观察线粒体自噬的情况。
2. 倒置显微镜观察：利用倒置显微镜观察细胞的生长状态和形态变化。
3. 激光共聚焦显微镜观察：利用激光共聚焦显微镜观察细胞的荧光信号和定位情况。
五、数据分析1. 图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察到的图像进行分析，测量线粒体自噬的相关参数，如自噬体数量、大小等。
2. 定量分析：采用定量PCR、Western blot等方法对实验数据进行定量分析，比较不同处理组之间的差异。
3. 统计分析：采用统计软件对实验数据进行统计分析，计算相关指标和参数，比较不同处理组之间的差异显著性。
六、结果解读根据实验结果，分析线粒体自噬在相关生理或病理过程中的作用和机制，探讨其与疾病的关系，为进一步的研究和应用提供理论依据。
七、实验总结根据实验结果和数据分析，总结实验结论，评估实验的优缺点，提出改进意见和建议，为后续的研究和应用提供参考和借鉴。
细胞自噬机制范文
细胞自噬机制范文细胞自噬是一种细胞自身进行的分解和回收机制，通过将受损或不需要的细胞器和蛋白质降解成基本的分子，为细胞提供能量和原料。
这个过程对于维持细胞内环境的稳定性、细胞发育和细胞适应环境变化至关重要。
细胞自噬机制包括自噬体形成、融合和降解三个阶段。
首先，细胞自噬的第一步是自噬体形成。
该过程由甲基化抑制因子相关蛋白1(LC3)调控，LC3是细胞自噬的标志蛋白。
初始的LC3被加工形成微管相关蛋白1A(LC3-I)，LC3-I会通过一个酶化反应转变为LC3-II。
LC3-II的形成需要有微管相关蛋白1(I/II)注解蛋白(ATG7)和微管相关蛋白1B(I/II)注解蛋白(ATG3)的参与。
LC3-II是一个疏水性的膜结合蛋白，会在受损或不需要的细胞器周围形成自噬包膜。
接下来，细胞自噬的第二步是自噬体与溶酶体免疫融合。
自噬体会与早期内体（一种与内质网关联的液泡）融合形成自噬体溶酶体（autolysosome）。
这种融合过程主要通过自噬体融合蛋白家族来调节，包括自噬体融合蛋白1（ATG8）和自噬体融合蛋白6(ATG6)等。
ATG8的转变也是自噬体融合的关键步骤。
此外，早期内体与自噬体融合还需要液泡核膜、早期内体单一周膜蛋白A（VAMP7）和激活蛋白Ras相关蛋白1 (Rab7)的参与。
最后，细胞自噬的第三步是自噬体内的降解。
当自噬体与溶酶体融合后，酸性环境和酶的存在会降解自噬体包膜中的物质。
在自噬体溶酶体中起关键作用的是组成酸性蛋白酶的酶体溶酶体蛋白酶B（CTSD）。
酸性环境可以通过调节自噬体酸化蛋白a，维持酸性环境以促进降解。
细胞自噬机制对于细胞内各种生命活动都起到重要作用。
它能够通过降解老化或受损的细胞器，来维持细胞的功能和寿命。
细胞自噬还可以在缺乏营养时为细胞提供能量和代谢物质。
此外，细胞自噬还参与细胞的免疫功能、肿瘤形成和神经退行性疾病的发生等。
细胞自噬机制的失调与多种疾病的发生密切相关。
例如，细胞自噬的缺陷会导致肿瘤的形成，因为肿瘤细胞需要维持高水平的细胞代谢和增殖。
关于细胞自噬的相关研究成果
关于细胞⾃噬的相关研究成果关于细胞⾃噬的相关研究成果姓名：陶宗学院：化学化⼯学院专业：化学学号：160106010012016年度诺贝尔⽣理学与医学奖刚揭晓不久，获奖者为⽇本科学家⼤隅良典（Yoshinori Ohsumi），以奖励他在“细胞⾃噬机制⽅⾯的发现”。
⼀、概述细胞⾃噬这是细胞组分降解与再利⽤的基本过程。
“⾃噬”(autophagy)⼀词源于希腊语前缀“auto-”，意为“⾃我”，以及另⼀个希腊语单词“phagein”，意为“吞⾷”。
因此，⾃噬作⽤的意思⾮常明确，那就是“⾃我吞噬”。
“⾃噬”的概念由⽐利时科学家Christian de Duve 在1963年溶酶体国际会议上⾸先提出，是指⼀些需降解的蛋⽩质和细胞器等胞浆成分被包裹，并最终运送⾄溶酶体降解的过程，⾃噬性降解产⽣的氨基酸和其他⼀些⼩分⼦物质可被再利⽤或产⽣能量。
现已明确，⾃噬的主要功能之⼀实际上是在细胞受到应激性的死亡威胁时保持细胞的存活，这是真核细胞维持稳态、实现更新的⼀种重要的进化保守机制。
虽然⼴义上的⾃噬包括巨⾃噬(macroautophagy)、微⾃噬(microautophagy)和分⼦伴侣介导的⾃噬(chapeon-mediated autophagy)三种类型，通常所说的⾃噬即指巨⾃噬，也是⽬前研究最多的。
对这⼀过程开展研究⾮常困难，这也就意味着我们对其知之甚少。
直到上世纪1990年代，在经过⼀系列出⾊的实验之后，⽇本科学家⼤隅良典利⽤⾯包酵母找到了与⾃噬作⽤有关的关键基因。
随后他开始致⼒于阐明酵母菌体内⾃噬作⽤的背后机制，并发现与之相似的复杂过程也同样存在于我们⼈类的细胞内。
⼤隅良典的研究更新了我们关于细胞物质循环的旧有观点，他的研究开启了理解⾃噬作⽤在许多⽣理过程中关键作⽤的崭新道路，如⽣物体对于饥饿的适应或者机体对于感染的反应。
⾃噬基因的突变会导致疾病的发⽣，⾃噬作⽤机制在⼀些类型的疾病，如癌症和神经疾病等病症中也发挥了作⽤。
大庆市四中2020届高三生物4月月考试题含解析
（3）①该实验的目的是验证上述蓝色块状物变小是淀粉酶的作用,在淀粉酶的作用下淀粉水解产生了还原糖，还原糖用斐林试剂检测会出现砖红色沉淀。1号试管加的是缓冲液和淀粉,作为对照试验,其可以排除用于实验的淀粉溶液中含有还原糖。
(4）自噬性溶酶体内的物质被水解后,其产物除图中排出细胞外,还可以为细胞生命活动提供游离的小分子营养物质。由此推测，当细胞养分不足时,细胞“自噬作用”会增强。
【点睛】解答本题的关键是根据题图理清自噬泡的形成，受损、变性、衰老的蛋白质与介导分子的结合过程，结合题意进行分析解答.
8。为探究玉米籽粒发芽过程中一些有机物含量的变化,研究小组利用下列供选材料用具进行了实验。材料用具：玉米籽粒；斐林试剂，双缩脲试剂，碘液，缓冲液，淀粉,淀粉酶等;研钵，水浴锅，天平，试管，滴管，量筒，容量瓶，显微镜,玻片,酒精灯等。请回答下列问题：
蛋白质是生命活动的主要承担者,蛋白质的结构多样，在细胞中承担的功能也多样：①有的蛋白质是细胞结构的重要组成成分,如肌肉蛋白；②有的蛋白质具有催化功能,如大多数酶的本质是蛋白质；③有的蛋白质具有运输功能，如载体蛋白和血红蛋白;④有的蛋白质具有信息传递，能够调节机体的生命活动,如胰岛素；⑤有的蛋白质具有免疫功能，如抗体。
（3)为了验证上述蓝色块状物变小是淀粉酶作用的结果，设计了如下实验：在1～4号试管中分别加入相应的提取液和溶液（如图所示）,40 ℃温育30 min后，分别加入斐林试剂并60 ℃水浴加热，观察试管内颜色变化。请继续以下分析：
①设置试管1作为对照，其主要目的是_______________________。
(2)已知受损、变性、衰老的蛋白质与某种介导分子结合才能进入溶酶体，若不结合很难进入溶酶体，这说明介导分子与溶酶体膜受体之间的结合存在____,受体的化学本质是_____。
细胞自噬检测的具体步骤及方法
细胞⾃噬检测的具体步骤及⽅法细胞⾃噬检测的具体步骤及⽅法⼀、⾃噬体介绍⾃噬（Autophagy），或称⾃体吞噬，是⼀个涉及到细胞⾃⾝结构通过溶酶体机制⽽被分解的过程，该过程是⼀个受到紧密调控的步骤，帮助细胞产物在合成、降解以及接下来的循环中保持⼀个平衡状态。
细胞接受⾃噬诱导信号后，在胞浆的某处形成⼀个扁平的类似“脂质体”样的膜结构，称为Phagophore。
随着Phagophore不断延伸，将胞浆中的细胞器等成分，全部包裹住成为密闭的结构，称为“⾃噬体（autophagosome）”。
⾃噬体形成后，可与溶酶体融合，⾃噬体中的内容物随即被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利⽤，⽽残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。
⾃噬信号通路：⼆、⾃噬研究策略和⽅法正常细胞基础⽔平⾃噬活性⽐较低，对⾃噬研究通常需要进⾏⼈⼯调节和⼲预，常⽤药物有：1、⾃噬诱导剂a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质⽹应激；b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）；c) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿；d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂；e) Rapamycin：mTOR抑制剂；f) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂。
2、⾃噬抑制剂a) ⾃噬抑制剂3-Methyladenine（3-MA）：(Class III PI3K) hVps34 抑制剂；b) Bafilomycin A1：质⼦泵抑制剂；c) 溶酶体抑制剂Hydroxychloroquine（羟氯喹）。
3、⾃噬检测1) 透射电镜；电镜作为⾃噬检测的⾦指标。
细胞代谢中的自噬途径与外泌体-细胞生物学论文-生物学论文
细胞代谢中的自噬途径与外泌体-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：在真核生物中，细胞可以通过自噬(autophagy)和外泌体(exosome)的分泌两种方式来对外界刺激做出应答从而维持细胞内稳态。
自噬是溶酶体依赖性细胞组分降解的过程，其能被氧化应激、饥饿或蛋白质聚集等因素导发生。
除了自噬途径，细胞还可以通过分泌外泌体来调节细胞的生命活动，新的研究表明自噬与外泌体发生有同样的分子机理。
本文综述了自噬与外泌体发生的过程以及两者之间的联系。
关键词：自噬; 外泌体; 内涵体; 自噬内涵体; 溶酶体;Abstract：Eukaryote cells can respond to extracellular stimuli via autophagy and exosome secretion to maintain intracellular homeostasis. Autophagy is a process of intracellular components degradation via lysosomal-dependent pathway, which can be induced by oxidative stress, starvation and protein aggregation. In addition toautophagy, cells can regulate cellular metabolism by secreting exosomes. Recent studies show that autophagy share common molecular mechanism with exosome biogenesis. This review summarized the processes of autophagy and exosome biogenesis, and the interaction between them.Keyword：autophagy; exosome; endosome; amphisome; lysosome;内膜系统是指在结构、功能，甚至生物发生方面彼此相关的、由单层膜包被的细胞器或细胞结构，主要包括内质网(endoplasmic reticulum,ER)、高尔基体、溶酶体、内涵体和分泌囊泡。
细胞自噬预实验
细胞⾃噬预实验细胞⾃噬预实验化学染⾊法1、试验⽬的通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染⾊⽊犀草素处理后的HepG2细胞判断⽊犀草素是否诱导HepG2细胞发⽣⾃噬。
2、试验原理3，6－（⼆甲胺基）吖啶盐酸盐，分⼦式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分⼦量438.12g/mol,是⼀种荧光⾊素，其检测激发滤光⽚波长488nm,阻断滤光⽚波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜⾊的荧光，与DNA 结合量少发绿⾊荧光，与RNA结合量多发桔黄⾊或桔红⾊荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染⾊。
AO也可以渗透进⼊酸性细胞器，例如⾃噬溶酶体，发⽣⾃噬的细胞经吖啶橙染⾊，在荧光显微镜下可观察到红黄⾊点状体，称为酸性⼩体，当PH值较低的时候，AO发出红⾊荧光，且强度与酸性程度相关。
所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。
3、试验材料及试剂HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、0.25%胰蛋⽩酶、吖啶橙（AO）、⽊犀草素、6孔板、载玻⽚、盖玻⽚AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融⼊10ml三蒸⽔中，配置成储备液。
实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染⾊液。
4、试验⽅法1）取对数期⽣长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加⼊终浓度为50uM、100uM、200uM的⽊犀草素及100uM的5-Fu，药物处理48h。
2）药物处理后，⽤PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。
3）将细胞悬液1000rpm离⼼3min，去掉上清，加⼊PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。
4）取300ul细胞悬液，加⼊染⾊液⾄终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染⾊结束后⽤PBS清洗3次，1000rpm离⼼3min，涡旋震荡混匀6）最后⼀次离⼼后留下少量液体，取10ul染⾊后的细胞滴加在载玻⽚上，盖上盖玻⽚7）把临时装⽚放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数⽬相似的视野进⾏拍照。
哺乳动物细胞自噬的研究方法资料
哺乳动物细胞自噬的研究方法摘要：细胞自噬参与多种生理和病理过程。
因此，科学研究中需要对细胞自噬进行精确识别、定量以及对自噬过程进行操作。
然而，因为细胞自噬是动态和复杂的过程，所以对其进行的分析经常是不准确的。
在本文中，我们讨论监控细胞自噬和调控细胞自噬活动的方法，尤其关注哺乳动物细胞巨型自噬。
前言过去十年，对称之为自噬的细胞基本生物学过程有了“爆炸”性的研究。
细胞自噬过程中所必需的进化保守基因的发现（最先在酵母中确认），促使科学家揭示了一系列关于细胞自噬对内环境稳态、发育过程以及其他生理功能的影响。
此外，更多的证据提示细胞自噬的异常可以引起很广泛的哺乳动物疾病(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008)。
因此，科学家就急迫需要对多种多样生物过程中的细胞自噬进行检测及功能研究，尤其是在哺乳动物中。
哺乳动物细胞自噬研究历来受两个主要因素的困扰。
第一，用静态的检测手段捕获一个动态的过程本身就是一个困难，以及基于这些检测手段的生物学干预的先天性限制。
第二，区分形态和功能是另一个挑战，在特定的生理条件下对细胞自噬的研究中，要避免由于检测手段的缺陷将这种生理功能认定为细胞自噬。
过去我们对哺乳动物细胞自噬功能的误解主要是以上两种原因导致的。
比如，在特定的神经、肌肉退行性疾病中，由于细胞自噬早期中间产物积累增多，似乎代表了细胞自噬通路后期阶段被抑制，这些疾病就被认为或部分被认为是由于细胞自噬增多引起（基于细胞自噬过程中早期中间产物数量的增多）(Levine and Kroemer, 2008; Mizushima et al., 2008; Rubinsztein, 2006)。
细胞自噬是一种常见的细胞死亡过程中的形态特征，经常被错误的认定为是一种细胞死亡通路，然而现在可以明确细胞自噬主要功能之一是：在恶劣条件下，细胞自噬使细胞能存活(Kroemer and Levine, 2008)。
细胞自噬检测
2、5 细胞裂解细胞从培育皿上被刮下来以后 ,在 15ml 灭菌塑料试管顶用 PBS 清洗 3 次,每次清洗用 10mlPBs 充足重悬细胞 ,在 4“c下 5009 离心 5min。
全部操作在冰长进行。
最后一步清洗把细胞转移到 1、smlePpendorf管中。
把细胞充足重悬在 TAP 细胞裂解液中。
依据细胞量决定裂解缓冲液的体积 (一般每 10 川细胞用 100 川一 200 川 TAPBu 价 r)。
搁置于冰上 30min,每 10min 用移液枪吹打细胞一次使之充足悬浮。
在 4OC 下用 100009 高速离心 15min,把上清转移到新的试管中进行下一步实验 ,抛弃积淀。
2、13 细胞自噬活性的检测我们主要经过两条门路来引诱细胞发生自噬,一饥饿办理 ,二药物 RaPamycin 办理。
对于饥饿办理 ,吸去正常培育的细胞中的培育液,用 PBS 当心清洗细胞三次,注意不要使细胞离开培育皿 ,加入 15mlEBss( 用量依据培育皿的大小而定)连同 2 林 M 的 ED64 与 pePstatin。
在 37“C培育箱中培育 2 一 4h。
关于 RaPamycin 办理 ,在一般细胞培育液中加入终浓度为500nM 的 R 叩 amyein(sigma)37“e下培育12h。
细胞自噬活性的检测主要有两条门路,一条就是经过转染GFP 一 LC3, 再用荧光显微镜察看LC3在细胞质中的齐集。
二就是用westemblotting 与 LC3 的抗体 ,检测细胞内源LC3n 的增添。
关于荧光显微镜剖析,在U20S 细胞中转染 GFP 一 LC3,24h 以后 ,把细胞继代培育在有盖玻片的 6 孔板中 ,引诱自噬 ,吸去培育液 ,用 PBS 当心润洗玻片 1 次,在每个孔内加入 3% 的多聚甲醛 ,在室温下闭光摇摆培育玻片 20min 。
用 PBS清洗玻片3 次,每次每孔加2mlPBS 在室温下摇摆10min,用固定液把盖玻片固定在载玻片上 ,在室温下干燥 1min 以后用荧光显微镜察看。
中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究
中波紫外线诱导HaCaT细胞自噬的研究王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【摘要】目的探究中波紫外线(UVB)诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT自噬效应及其信号通路.方法 30 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后,透射电镜和MDC染色法观察自噬小体的变化,Western Blot检测自噬和凋亡相关蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化.结果 30mJ/cm2 UVB照射24 h后,电镜下可见自噬小体增多,内含待降解的细胞器和折叠蛋白;MDC染色可见细胞自噬囊泡增多,荧光强度增强;Western Blot结果显示自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和SQSTM1表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达增加,p-mTOR表达降低;运用3-Methyladenine(3-MA)和siATG5抑制自噬后,LC3-Ⅱ表达降低,细胞凋亡率增加,增殖减慢,凋亡蛋白Cleaved-PARP表达增加,AMPK/mTOR通路中的关键蛋白AMPK、p-ULK1表达下降,p-mTOR表达增加.结论 UVB通过AMPK/mTOR通路诱导了HaCaT细胞的保护性自噬.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2019(035)012【总页数】6页(P1910-1914,1919)【关键词】中波紫外线;人永生化角质形成细胞;自噬;凋亡【作者】王超鹏;蒋丽君;陈富强;周美娟【作者单位】南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515;南方医科大学公共卫生学院放射医学系,广东省热带病研究重点实验室广州510515【正文语种】中文日光中的紫外线，尤其是中波紫外线（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人体表皮细胞损伤最常见的环境因素之一。
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细胞自噬预实验
化学染色法
1、试验目的
通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。
2、试验原理
3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。
AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。
所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。
3、试验材料及试剂
HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、
0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片
AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。
实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。
4、试验方法
1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物
处理48h。
2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。
3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。
4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀
6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片
7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。