神经干细胞移植治疗帕金森病的研究进展

神经干细胞移植治疗帕金森病的研究进展袁野1，丁继固2（1．武汉大学基础医学院研究生，湖北武汉430071；2．咸宁学院基础医学院人体解剖学教研室）中图分类号：R742．5文献标识码：C文章编号：1008-0635（2011）01-0090-03帕金森病（parkinson’s disease，PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元（dopaminergic neu-ron，DN）变性坏死，导致神经递质多巴胺（dopa-mine，DA）及代谢物含量减少，从而引起锥体外系功能失调，临床上出现震颤、麻痹、运动强直等行为障碍［1］。

传统的PD药物治疗应用左旋多巴（L-dopa）以纠正患者脑内DA神经递质的缺乏，可明显改善患者的运动症状，但长期使用L-dopa 会出现神经系统及精神行为等方面的副作用，从而影响治疗效果。

腹后苍白球毁损术等外科治疗定向破坏作用过强的神经元可改善某些运动症状，而且手术时机、部位选择及术后康复方面存在诸多问题。

因药物治疗和外科手术只能改善症状，尚不能控制病程的发展，不能从根本上解决这个问题。

能否用健康的DN替代被破坏的DN，恢复纹状体DA的神经释放，从而在根本上解决PD 这个问题引起了研究者的极大兴趣。

为克服这些问题，经过不断尝试人们将目光转向了神经干细胞（neural stem cells，NSCs）。

1988年Lindvall 等［2］开展了第1例人胚胎干细胞中脑移植治疗原发性帕金森病，在很大程度上缓解了患者的临床症状。

近几年对帕金森病的治疗已逐渐转向间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、神经干细胞（neu-ral stem cell，NSCs）的基础和临床实验及应用研究，使得帕金森病的治疗成为可能与可行。

本文就神经干细胞治疗帕金森病研究进展的有关问题作一简要综述。

1神经干细胞及生物学特性神经干细胞是指存在于成体脑组织中的一种干细胞，可分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。

1992年Reynolds和Weiss［3］最先提出了神经干细胞的概念。

它具有以下特点：有增殖能力，在整个生命过程中能自我更新，能通过扩增而产生大量子代，具有向多细胞分化的能力。

目前，NSCs的生物学特性仍未完全阐明，且不同部位来源的NSCs特性是否完全相同也少有报道。

以往研究提示不同部位来源的NSCs在生长特性和分化规律的特性可能有所不同。

将这些干细胞或转染基因后的干细胞移植于被毁损的大鼠脑内，可成功地恢复多巴胺水平，以达到治疗帕金森病的目的。

间充质干细胞、胚胎干细胞和成年脑组织干细胞（神经干细胞）均可产生多巴胺能神经元，从而为帕金森病的移植治疗提供细胞来源。

2神经干细胞的分化随着中枢神经系统不同部位NSCs的分离和体外培养技术的成功建立［4］，为在体外研究NSCs 的生长特性及其分化规律提供了很好的细胞模型，也为细胞移植治疗CNS特定部位的病变和损伤奠定了基础。

如何诱导NSCs的增殖，促使其向神经元分化，以弥补已丢失的神经元功能，成为NSCs研究的焦点。

NSCs在发育过程中其增殖、分化调控机制非常复杂。

目前普遍认为除NSCs 本身所具有的内在分化程序外，局部环境中的各类细胞因子、炎症介质、细胞外基质及细胞间的相互作用等均可能影响NSCs的分化［5］。

2．1神经干细胞分化的内在因素神经干细胞的分化受细胞自身基因和外来信号两种机制调控［6］。

神经干细胞的分化首先是基因选择性地表达各自特有的专一性蛋白质而最终导致细胞形态、结构与功能的差异。

许多转录因子参与细胞基因的调控，它们在特定时间通过某一途径被激活后，引起或关闭下游基因的表达，决定着神经干细胞的分化命运。

同一来源的神经干细胞移植到不同部位后，其分化结果也不相同，但往往与接受移植部位的细胞相似，提示外来信号调控作用的重要性。

2．2神经干细胞分化的外在因素神经干细胞分化为何种类型的神经细胞，不仅取决于内在的基因调控，更受所处环境中包括细胞因子等微环境的影响［7］。

神经营养因子不仅对中枢和外周神经系统神经元的存活及其突起生长有促进作用，也对NSCs和祖细胞的分化起一定的作用。

不同种类的细胞因子、同一细胞因子不同浓度以及多种细胞因子联合应用对NSC诱导分化作用各不相同，且不同阶段，相同细胞因子的作用亦不同。

Ling和Potter［8］等通过18种细胞因子诱导大鼠神经干细胞定向分化作用的筛选，发现只有IL-1α和IL-1β能够诱导中脑来源的神经干细胞向TH阳性神经元分化，两者诱导分化的效果无明显差异。

而IL-11、LIF和GDNF本身没有明显的诱导分化作用，但却能明显地提高TH 阳性多巴胺神经元的存活率。

3经干细胞向多巴胺能神经元定向诱导分化及检测其具体操作步骤参照文献［9 11］进行。

第一步，NSCs的原代分离培养。

第二步，NSCs的传代分离培养。

第三步，NSCs的诱导分化，撤去生长因子bFGF及添加剂B27。

按所选定的诱导因子分组诱导分化：如GDNF、IL-1β细胞诱导因子，并设对照组。

第四步，NSCs免疫细胞化学鉴定，对未分化的细胞进行巢蛋白（Nestin）检测，对有血清培养分化10 12d的细胞分别进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和酪氨酸羟化酶（TH）检测。

第五步，流式细胞术检测（TH）阳性细胞。

4神经干细胞移植治疗帕金森病的应用4．1神经干细胞移植治疗帕金森病的机制神经干细胞移植治疗帕金森病的目的是修复黑质神经元变性引起的纹状体多巴胺能通路损伤。

其主要机制有3个方面：①分化为多巴胺能神经元的替代作用；②对多巴胺能神经元保护及营养作用；③促进内源性多巴胺能神经元的发生。

4．2神经干细胞移植治疗帕金森病的方法神经干细胞移植用于治疗帕金森病的方法主要有两种。

第一种方法，将干细胞或前体细胞进行移植，使其在体内分化为多巴胺能神经元，这些神经元可以与宿主细胞整合，重建黑质纹状体通路。

Piccini等［12］采用从人胚胎的腹侧中脑内分离出黑质细胞植入帕金森病病人脑中，结果发现有一半以上的病人症状明显改变而且效果持续存在。

Jitka等［13］应用未经工程化的神经干细胞植入帕金森氏病大鼠的中脑后一段时间，发现宿主部分细胞的酪氨酸羟化酶及多巴胺转运体活性恢复改变了宿主受损部位的微环境，对受损但尚未凋亡的多巴胺能神经元具有保护作用。

第二种方法，在体外将神经干细胞提前分化为多巴胺能神经元后再移植，即干细胞作为种子细胞。

4．3神经干细胞转基因移植治疗帕金森病4．3．1基因转染路径主要包括直接法和间接法。

直接法，就是直接将目的基因转入动物治疗靶区。

间接法，将目的基因首先在体外转入适当的靶细胞，再将转基因靶细胞植入动物脑内发挥治疗作用。

不管哪一种转基因路线，都涉及如何将目的基因带入治疗靶区并进入细胞内的问题，即基因的转移载体（细胞模型）［14］。

细胞模型是基因治疗研究的重要工具，如干细胞、胶质细胞等都可以通过个别或联合转移一种或多种多巴胺合成酶基因，或神经营养素基因制备成帕金森病细胞模型进行基因治疗的研究。

4．3．2基因转染病毒载体病毒载体是基因转染的主要选择，常用的病毒载体包括腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺相关病毒载体以及逆转录病毒载体等。

质粒载体是基因治疗常用的非病毒载体之一，尤其在帕金森病间接法治疗途径的基因转移过程中，是转染靶细胞的有效工具。

选择的基因有如下几类。

①caspase-3亚家族抑制蛋白XIAP（X-chro-Mosome-1inked inhibitor of apoptosis）基因、半胱氨酸蛋白酶、抗凋亡基因、如Bc1-2基因等。

②神经营养因子基因，如成纤维细胞生长因子、胶质细胞源性神经营养因子、人类肝细胞生长因子、脑源性神经营养因子等。

其中胶质细胞源性神经营养因子、IL-1β成为在人体内进行试验的神经营养因子之一［15］。

③酶或蛋白质基因，如GCH酶基因、酪氨酸羟化酶、多巴胺脱羧酶、抑制性氨基酸递质酶基因等。

⑤其他基因，如下游转录激活物转录因子Gli-1基因、多巴胺神经元分化因子（differentiation factor）、Sonic Hedgehog（Shh）、DJ-1基因、parkin基因与а-synuclein基因等。

4．3．3移植动物模型第一种模型，是最常使用的帕金森病动物模型，应用6-羟多巴胺（6-OHDA）立体定向微量注人大鼠单侧黑质、内侧前脑束以及纹状体建立偏侧帕金森病大鼠旋转模型。

第二种模型，是向小鼠、C57黑鼠或灵长类动物腹腔注射MPTP（MPP +），建立双侧黑质损伤鼠模型或一侧颈内动脉注射MPTP（MPP+），建立单侧黑质毁损的帕金森病旋转模型，用于帕金森病基因治疗的研究。

5问题及展望真正将神经干细胞用于治疗帕金森的临床实际应用还存在很多问题有待研究解决。

如，怎样选择合适的供体干细胞（如胚胎干细胞、间充质干细胞或神经干细胞等）；怎样更科学合理培养、纯化神经干细胞；怎样更科学合理选择诱导因子；怎样选择合适的移植方案、移植干细胞的保存方式、移植干细胞数量、移植干细胞靶点的选择等。

怎样解决干细胞移植后的安全性及致瘤性问题；怎样解决神经干细胞移植后能否存活、恢复以及远期疗效等。

基因治疗在技术上也还有许多问题需要解决，由于可供选择移植的目的基因越来越多，不同目的基因联合移植治疗帕金森病成为目前的一种方向，但这些研究在适用性、技术、神经生物学等方面均存在一些问题。

但有理由相信，随着神经干细胞移植治疗帕金森病的基础研究和临床研究的不断深入，相信在不远的将来，神经干细胞移植治疗好帕金森病终会成为可能与可行。

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