引物设计部分使用说讲义明初学者超级推荐
引物设计-初学者超级推荐
Frq为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件 中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。
用Oligo 设计引物时的3个标准
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有 利于引物引发聚合反应。 Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的 片段。 Δ G 值在5’端和中间值比较高，而在3’ 端相对低
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密 码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切 位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
引物设计的原理和程序
1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。
但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。
因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。
所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。
下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。
①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(F alse priming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。
②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。
特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。
③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。
④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。
⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairp in)，AG高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。
⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。
⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。
而以m RNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。
引物设计——手把手教新手
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。
⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各种强大的引物分析功能了。
引物设计知识点汇总
引物设计知识点汇总引物设计在分子生物学和遗传学研究中起着至关重要的作用。
引物是用于特异性扩增DNA片段的短寡核苷酸序列，需要准确设计以保证扩增效率和特异性。
本文将汇总引物设计的相关知识点，包括引物选择、引物设计策略和引物设计工具等。
一、引物选择引物的选择是引物设计的第一步，关键点如下：1. 引物长度：一般选择18-22个碱基对的短寡核苷酸作为引物长度，过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物则增加了扩增难度。
2. 引物的GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量可能导致不稳定的引物结合和扩增效率下降。
3. 引物的翻译调谐能力：引物的序列应尽可能避免出现自身互补的二级结构，避免引物之间的相互结合，以保证扩增特异性。
4. 引物的特异性：引物应具有较高的特异性，即只特异性地扩增目标DNA片段，而不扩增非目标DNA。
二、引物设计策略在引物设计过程中，有以下几种常用的引物设计策略：1. 引物序列比对：将引物序列与目标序列比对，选择引物与目标序列高度互补的区域作为引物的设计区域。
2. 引物性能评估：使用引物设计工具对设计的引物进行性能评估，评估指标包括特异性、互补性、剪切位点等。
3. 引物序列调整：根据引物评估的结果，对引物序列进行调整，如调整引物的长度、GC含量等。
4. 引物结构优化：通过调整引物的二级结构和碱基组成，优化引物的稳定性和特异性。
三、引物设计工具引物设计工具可以帮助研究人员快速设计合适的引物，常见的引物设计工具有：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计软件，提供了丰富的设计选项和参数调整，可以根据用户需求生成高质量的引物序列。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST结合了引物设计和引物特异性评估的功能，能够为用户提供特异性较高的引物设计方案。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是一款在线工具，可以评估引物的各项性质，如熔解温度、稳定性等。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
引物设计——手把手教新手
引物设计——手把手教新手引物设计是指在实验室中用于特定目的的DNA序列，用于扩增特定的DNA片段。
引物设计在分子生物学研究和遗传工程方面起着至关重要的作用。
对于新手来说，如何设计合适的引物是一个基础且重要的技能。
下面将以一种扩增人类基因的引物设计为例，手把手地教新手进行引物设计。
首先，我们需要确定扩增的目标基因。
假设我们的目标基因是人类TNF-α基因。
TNF-α是一种调节免疫反应的细胞因子，与一些疾病如炎症性疾病、自身免疫性疾病等密切相关。
因此，深入研究TNF-α基因的功能和表达是非常重要的。
第二步是获取TNF-α基因的序列。
我们可以在公共数据库如NCBI （National Center for Biotechnology Information）中人类TNF-α基因的序列。
在NCBI的网站上，可以输入关键词“human TNF-alpha gene sequence”，并选择合适的结果进行。
我们可以找到人类TNF-α基因的RefSeq基因组序列。
然后，我们需要对所获得的基因序列进行分析，以确定扩增的目标区域。
在TNF-α基因中，选择合适长度的外显子或启动子区域作为目标区域进行扩增。
在选择时，需要考虑该区域的特异性和扩增效率。
接下来，我们需要使用一些在线工具来进行引物设计。
有许多免费的引物设计工具可供选择，如Primer3、NCBI Primer-BLAST等。
在这里，我们将使用Primer3进行引物设计。
在Primer3的网站上，可以将TNF-α基因的目标区域序列粘贴到“SEQUENCE INPUT”输入框中。
然后，可以设置一些参数，如引物长度、Tm值、GC含量等。
对于引物长度，通常选择18-25个核苷酸；Tm值通常在55-65°C之间；GC含量通常在40-60%之间。
设置好参数之后，点击“PICK PRIMERS”按钮，即可获得计算结果。
得到计算结果后，将得到一对引物的序列和其他相关信息，如引物的Tm值、GC含量、特异性等。
引物设计（特别有用,良心推荐）
引物设计（特别有用,良心推荐）引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
微生物 通用引物设计-概述说明以及解释
微生物通用引物设计-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以包括对微生物和引物设计的简要介绍。
以下是一个例子:引言部分会对微生物和引物设计进行概述。
微生物是一类单细胞或多细胞的微小生物，包括细菌、真菌、病毒和藻类等。
这些微生物广泛存在于地球上的各个环境中，包括土壤、水体、大气等。
微生物在生态系统中起着至关重要的作用，如参与养分循环、有机物降解、生物防治等。
此外，微生物还对人类和动植物的健康具有重要影响，既可以致病也可以为人类提供有益的功能。
引物是在分子生物学研究中常用的工具，用于扩增特定基因片段或序列。
引物的设计是进行分子生物学实验的关键步骤之一。
引物必须具有与目标序列互补的碱基序列，以便能够特异性地结合并扩增目标序列。
引物设计的好坏直接关系到实验结果的准确性和可靠性。
在本文中，我们将探讨微生物的重要性以及引物设计的意义和原则。
深入了解这些内容将有助于我们更好地理解微生物世界，加强对微生物的研究和应用。
在接下来的章节中，我们将详细讨论微生物的重要性和引物设计的意义，以及引物设计的一些基本原则。
通过阅读本文，读者将能够更好地理解微生物的重要性和引物设计的关键作用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在介绍本篇长文的整体架构和章节划分，以及每个章节的内容安排。
本文共包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分将在开始时对微生物通用引物设计进行概述，介绍其背景和相关概念。
接着，将详细说明文章的结构，列举各个章节的标题和内容，以让读者了解全文的组织结构。
正文部分是本篇长文的核心部分，将涵盖微生物的重要性、引物设计的意义以及引物设计的原则三个小节。
在微生物的重要性一节中，将介绍微生物在自然界和人类生活中的重要作用，以引起读者对微生物的关注。
在引物设计的意义一节中，将阐述设计合适的引物对于微生物研究的重要性，以及有效引物设计的意义。
在引物设计的原则一节中，将详细解释引物设计中需要考虑的因素和原则，并介绍一些常用的引物设计方法。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是生物学和生物技术领域中非常重要的一个环节。
在分子生物学研究、基因工程、医学诊断、疾病预防等方面，引物设计都起着至关重要的作用。
引物设计的好坏直接影响到PCR扩增、序列特异性分析、RNA干扰、原位杂交、基因克隆等实验的效果和结果。
因此，深入理解引物设计的相关知识点对于提高实验效率和结果的可靠性非常重要。
本文将介绍引物设计的相关知识点，并对其进行归纳总结。
1. 引物设计的基本原则引物是在分子生物学实验中用于对特定DNA或RNA序列进行扩增、检测或特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列。
设计好的引物对于实验的成功至关重要，而引物设计的基本原则包括：(1) 引物长度：引物长度一般在18-25碱基对之间，过短的引物可能导致扩增效率低，而过长的引物可能导致特异性差。
(2) GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的结合性能和特异性。
(3) 引物序列选择：引物的序列选择要尽量避免重复序列、近似重复序列和具有高度变异性的区域。
(4) 引物特异性：引物的特异性是指引物能够与目标序列特异性结合，而不结合其他非特异序列，引物特异性的好坏直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
2. 引物设计的常见问题及解决方法在引物设计过程中，常常会遇到一些常见问题，例如引物特异性不足、引物二聚体形成、引物偏向性扩增等问题。
针对这些问题，有一些解决方法可以参考：(1) 引物特异性不足：可以通过生物信息软件对引物进行预测和评估，合理选择引物序列，避免与非特异序列发生交叉杂交。
(2) 引物二聚体形成：引物二聚体是指引物之间相互结合形成二聚体，导致引物的扩增效率降低。
可以通过调整引物长度和序列，以及优化PCR扩增条件来避免引物二聚体的形成。
(3) 引物偏向性扩增：引物偏向性扩增是指引物对特定序列的扩增效率高于其他序列，可以通过优化PCR扩增条件，如调整引物浓度、反应体系等来解决。
引物设计知识点总结图解
引物设计知识点总结图解引物设计是分子生物学研究中至关重要的一步，它涉及到DNA/RNA的扩增、测序和定量等诸多实验。
本文将通过图解的方式，对引物设计的相关知识点进行总结。
具体涉及引物设计的基本原则、引物长度、引物序列的选择、引物的特异性、引物的GC含量以及二聚体的形成。
希望通过本文的阐述，读者能够更好地理解引物设计的要点和注意事项。
1. 引物设计的基本原则引物设计的基本原则包括：引物长度适当、引物序列具有特异性、引物的理论特性符合要求、引物的二聚体形成能力低等。
2. 引物长度的选择引物长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物容易出现非特异性扩增产物，而过长的引物则可能导致扩增效率降低。
因此，在设计引物时需要注意选择适当的长度。
3. 引物序列的选择引物序列的选择是引物设计过程中的核心步骤。
引物的序列应在目标区域能够满足特异性，避免与非目标区域有较高的同源性。
此外，引物序列的碱基组合应尽量避免存在重复序列、多聚碱基或者易形成二聚体的碱基组合。
4. 引物的特异性引物的特异性是评价引物设计质量的重要指标之一。
合理设计的引物应能够特异性地与目标DNA/RNA序列配对，并能够排除与非目标序列的配对。
特异性的引物可以有效地避免非特异性扩增产物的生成。
5. 引物的GC含量引物的GC含量对扩增反应的效率和特异性具有重要影响。
过高或过低的GC含量均可能导致扩增效率降低或产生非特异性扩增产物。
因此，在设计引物时需要合理调整引物的GC含量，并确保GC含量在适宜的范围内。
6. 引物的二聚体形成引物的二聚体形成是指引物之间可能发生的相互结合。
合理设计的引物应该不能形成稳定的二聚体，以避免引物在扩增反应中发生错误的配对，导致产物的异常。
通过上述的图解，我们可以清晰地了解引物设计的主要知识点和注意事项。
在实际的引物设计过程中，需要根据具体的实验目的和条件选择合适的引物设计策略，并结合生物信息学工具进行引物序列的设计和评估。
引物设计知识点归纳图解
引物设计知识点归纳图解引物设计是分子生物学和遗传学等研究领域中的重要工具，它在PCR扩增、基因克隆、基因表达分析等方面发挥着至关重要的作用。
在引物设计过程中，需要考虑引物的长度、碱基组成、熔解温度等因素，以确保引物的特异性和稳定性。
本文将围绕引物设计的基本原理、常用工具和实践技巧展开讨论，并通过图解的方式进行归纳总结。
一、引物设计的基本原理引物设计的目标是选择具有高特异性和稳定性的引物，以确保在PCR扩增等实验中的准确和可靠性。
其基本原理包括：1. 特异性：引物应与目标DNA序列的特定区域完全匹配，以避免非特异扩增。
2. 稳定性：引物应具有适当的长度和碱基组成，以确保引物在反应条件下的稳定性。
3. 熔解温度：引物的熔解温度应接近PCR扩增的反应温度，以保证引物的特异性。
二、引物设计的常用工具引物设计可以借助多种在线工具和软件来完成，常用工具包括：1. Primer3：一种广泛应用的引物设计工具，可以根据给定的参数自动设计引物，并进行热力学分析。
2. NCBI Primer-BLAST：结合NCBI数据库和BLAST算法的引物设计工具，用于检验引物的特异性。
3. OligoAnalyzer：根据序列特性进行引物设计和分析的在线工具，可以计算引物的熔解温度和配对特性。
三、引物设计的实践技巧在实践过程中，为了提高引物设计的准确性和效率，可以考虑以下技巧：1. 引物长度：引物的长度通常为18-25个碱基对，较短的引物具有更高的特异性。
2. GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，高GC含量可以增强引物的熔解温度和特异性。
3. 引物间配对：引物之间或引物与模板之间的配对应避免，以防止引物间的二聚体形成或引物与模板的非特异结合。
4. 引物位置：引物应位于目标序列的特异区域，避免引物与非目标序列的交叉反应。
5. 引物设计的复杂性：复杂的引物设计场景，如多组引物设计、引物与探针联合设计等，可以借助专业软件进行。
引物设计学习的知识点
引物设计学习的知识点引物设计是分子生物学和遗传学研究中的重要内容之一。
在科研实验中，合理设计引物能够提高结果的准确性和可重复性。
本文将从引物的定义、特点、设计原则以及常用的引物设计工具等方面介绍引物设计学习的知识点。
一、引物的定义引物是指在PCR（聚合酶链反应）等实验中，用于特异性扩增目标序列的短寡核苷酸序列。
引物通常由20-30个碱基组成，一般设计为与目标序列同一链的两个引物，一个用于扩增目标序列的5'端，另一个用于扩增目标序列的3'端。
二、引物的特点1. 特异性：引物应能够准确特异地与目标序列结合，避免与其他非目标序列结合。
2. 长度：引物的长度一般为20-30个碱基，过长或过短都可能影响扩增效率。
3. G-C含量：引物的G-C含量应合适，一般控制在40%-60%之间，过高或过低都可能影响扩增效率。
4. 无二聚体和自聚物形成：引物之间以及引物自身不得形成稳定的二聚体或自聚物，以免影响扩增效率。
三、引物设计原则1. 特异性：引物应具有足够的特异性，能够准确特异地与目标序列结合，避免与其他非目标序列结合。
2. 避免互补碱基：引物间及引物自身的互补碱基应尽可能避免，以免形成稳定的二聚体或自聚物，影响扩增效率。
3. 避免重复序列：引物中应避免存在重复序列，以免引起非特异性扩增。
4. 避免剪切位点：引物中应避免存在限制酶的剪切位点，以免扩增的目标序列被限制酶消化。
四、常用的引物设计工具1. Primer3：一款常用的引物设计软件，可根据用户输入的目标序列信息自动设计合适的引物。
2. OligoAnalyzer：一款在线引物分析软件，可对设计好的引物进行一系列的生物信息学分析，包括热力学性质、互补性等。
3. NCBI Primer-BLAST：利用NCBI数据库进行引物设计和分析的在线工具，可评估引物的特异性和互补性。
总结：引物设计是分子生物学和遗传学研究中不可忽视的重要环节。
合理的引物设计能够保证实验结果的准确性和可重复性。
引物设计知识点总结图
引物设计知识点总结图引物设计是在分子生物学研究中常用的实验技术之一，用于扩增目标DNA序列。
本文将就引物设计的相关知识点进行总结和图示，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
一、引物设计的基本原理在引物设计之前，我们需要了解PCR（聚合酶链式反应）的基本原理。
PCR是一种快速扩增DNA的方法，其关键在于引物的选择和设计。
引物是PCR反应中的两段寡核苷酸序列，分别与目标DNA序列的起始点和终止点互补配对。
通过PCR反应，引物与目标DNA序列结合，聚合酶随后从引物的3'端开始合成新链，形成所需扩增的DNA。
二、引物设计的关键要点1. 引物长度：引物长度通常为18-30个碱基，过短的引物可能无法特异性地结合目标DNA，而过长的引物则可能导致不必要的非特异扩增产物。
2. 引物序列：引物的序列应与目标DNA的互补序列相匹配，确保引物能够特异性地结合目标DNA并进行扩增。
3. 引物峰值温度(Tm值)：Tm值是引物设计中非常重要的参数，它表示引物与目标DNA的解链温度。
引物的Tm值应相似，以确保二者能够在相同的温度下扩增。
4. 引物GC含量：引物的GC含量直接影响其Tm值，较高的GC 含量通常意味着较高的Tm值。
适当调整GC含量可以帮助优化引物的扩增效率。
5. 引物间的相互作用：在引物设计过程中，需要避免引物之间的互补性，以免引物间发生二次结合导致非特异性扩增。
三、引物设计的步骤示意图[图示]四、引物设计的实际应用引物设计广泛应用于分子生物学领域中的DNA克隆、基因表达分析、突变检测等实验中。
具体应用包括：1. DNA克隆：通过引物设计扩增目标DNA序列，可用于获得目标基因的全长序列或特定片段。
2. 基因表达分析：通过引物设计扩增特定基因的编码区域，可用于研究该基因的表达水平和调控机制。
3. 突变检测：通过引物设计扩增包含突变位点的DNA片段，可用于检测目标基因的突变类型和频率。
五、引物设计的常见问题及解决方法1. 引物的Tm值差异较大：可通过调整引物的长度和GC含量来优化Tm值，使其相似。
手把手教你设计引物（图文并茂）
手把手教你设计引物（图文并茂）不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。
没有什么可回报的东西，就发个帖教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。
引物设计的帖子不少，以前很多战友会推荐Oligo、PrimerPremier、DNA man等等软件。
这些软件设计完最后还是要去BLAST比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法，觉得好的话请投个票。
就以人的PTEN基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是cDNA，就找它的mRNA序列。
如果你要做的是DNA，就找DNA的序列。
以cDNA为例，普遍的一种方法是上PUBMED中GENE栏搜索找到cDNA那栏，但PUBMED导出序列不太方便，我介绍个网站/index.html1. 输入目的基因，进入2.在左侧栏选择TRANSCRIPT，选择后进入3. 选择PTEN-001中的TRANSCRIPT进入，点击左侧cDNA4. 然后点击CONFIGURE THIS PAGE进入设置你要显示的内容5. 除了第一栏SHOWEXONS选择YES外，其他的都选择NO，然后取个名字保存SAVE CONFIGURATION AS6. 然后在左侧栏点击DOWNLOADVIEW AS RTF可下载你要的cDNA序列，这个文件可以用WORD打开，不同的颜色代表一个外显子间断下载后打开的WORD7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第6和第7外显子分别设计上下游引物。
选取并复制第6和第7外显子序列8. 登陆/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好RANGE和PCR产物的大小，然后在下面点击GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物9.最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，避免与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应避免高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）避免二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应避免引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）避免引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应避免以上情况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要考虑，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以方便后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以采用多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简单易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
引物设计知识点归纳
引物设计知识点归纳引物设计是分子生物学研究中的重要环节，它直接影响到PCR扩增反应的效果和准确性。
对于进行引物设计的研究人员来说，掌握相关的知识点非常重要。
本文将对引物设计的相关知识进行归纳总结，以帮助读者更好地理解和应用。
一、引物的选择1. 引物长度：引物通常由18-25个碱基组成，长度不宜过短也不宜过长。
过短的引物可能导致非特异性扩增，过长的引物则可能影响扩增效率。
2. Tm值：引物的熔解温度（Tm）是指引物与目标序列杂交时熔解的温度。
Tm值的选择应使引物在PCR反应温度下能够与目标序列准确结合。
3. 引物碱基组成：引物的碱基组成应均衡分布，避免多个相邻碱基相同或相似的情况，以防止非特异性扩增的发生。
4. GC含量：引物中的GC含量影响其稳定性和特异性。
一般而言，GC含量在40-60%之间效果较好。
5. 避免互补：引物之间应避免出现互补的情况，以免形成二聚体或产生非特异性扩增。
二、引物设计工具1. Primer3：Primer3是一个常用的引物设计工具，提供了包括引物长度、Tm值和GC含量等参数的设定。
2. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer是一款用于计算引物Tm值的工具，可以通过输入引物序列来预测其熔解温度。
3. BLAST：BLAST是一种用于在数据库中搜索引物靶点的工具，可以帮助判断引物的特异性。
4. UCSC in silico PCR：UCSC in silico PCR是一个在线工具，可以通过输入引物序列和目标序列来模拟PCR反应，判断引物的效果和特异性。
三、引物设计的注意事项1. 避免引物间二聚体：引物之间的互补性可能导致二聚体的形成，影响PCR反应的特异性和效果。
使用引物设计工具进行分析，避免引物间的互补性。
2. 引物特异性：引物应具有良好的特异性，即只与目标序列匹配，不与非目标序列杂交。
3. 引物位置选择：引物的选择应尽量位于目标序列的保守区域，以提高特异性和稳定性。
引物设计图文教程。
引物设计图⽂教程。
⼀顿操作猛如虎，⼀看战绩0-5。
尽管引物设计是PCR实验成功的前提，但是蛮多⼩伙伴的实战经验稍显不⾜。
今⼉就向⼤家介绍2种引物设计⽅法。
This is the dividing line.引物设计尽管是⽼⽣常谈了，但是⼩编还是想先把引物设计的原则放出来(其实是复制粘贴啦，哪哪都有)。
1、引物应⽤核酸系列保守区设计并具有特异性。
最好位于编码区5\'端的300-400bp区域内，可以⽤DNAMAN，Alignment软件看看结果。
2、不能形成2级结构。
3、引物长度⼀般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太⼤。
4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。
5、碱基要随机分布，尽量均匀。
6、引物⾃⾝不能有连续4个碱基的互补。
7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8、引物5‘端可以修饰。
9、3’端不可修饰，⽽且要避开AT，GC富集的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10、引物3\'端要避开密码⼦的第三位。
11、引物整体设计⾃由能分布5\'端⼤于3‘端。
12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。
原则忒多啦，⼩伙伴们，先别晕，看下⽅。
⽅法⼀：PrimerBank法⽹址：打开以上⽹址，进⼊PrimerBank⽹站界⾯，如下图个⼈觉得这是最便捷的引物获取⽅法，该⽹站可以⾮常迅速地检索到已经他⼈验证的引物序列及相关反应条件。
图中第⼀个⽅框，⼀般选择NCBI Gene ID；第⼆个⽅框选择你所关注的物种，常⽤的就是Mouse和Human了，如果为其它物种，则选择All Species即可；第三个⽅框中需要输⼊你关注的基因ID号码。
如何获取基因ID呢，这⾥就需要打开NCBI⽹站，选择Gene，并输⼊你的⽬的基因如p53 homo，选择第⼀个，可见其ID号为7157。
如下图所⽰。
然后将ID号7157输⼊上⽅PrimerBank⽹站的For text框中，并选择种属为⼈，点击Submit后，跳转页⾯如下。
不会设计引物肿么破？点这里呀
不会设计引物肿么破？点这里呀今天转载一个设计引物贴，作者ID是请叫我何博。
我们一起来学习一下他的设计引物方法，毕竟多一个方法，多一条出路。
刚进入研究生生活的菜鸟们很恼火，到底怎么设计引物啊？相信你看了这个干货之后就明白了哈哈哈。
引物（primer），就是一小段单链DNA或RNA，是DNA复制的起点，有了这个小小的引物才能延伸出我们需要的DNA序列（小小的东西往往发挥穿针引线的作用）。
现在设计引物有很多种方法，比如各种软件DNAman、Primer5.0、Snapgene、NCBI Web T ool等，这期主要讲述用NCBI Web Tool这个在线数据库设计引物。
首先你要下载自己要P的序列，当然了有很多的数据库可以选择，比如NCBI、Photozome、MaizeSeq（玉米研究）。
下面以fea2这个有关玉米穗突变的基因为例来说明整个设计引物过程。
1首先进入phytozome。
网址：/pz/portal.html在“Tools”的下拉菜单里选择“Keyword search”，页面跳转后，输入基因ID，选择物种，再点击GO。
2点击进入后，延伸序列的上下游（这里延伸长度按照实际情况选择）。
3进入NCBI主页，点击“Blast”。
网址：/接着点击“Primer Blast”。
4粘贴已得到的序列；修改引物结合范围，例如这个fea2这个基因长2489bp，上下延伸200bp之后，上游引物结合位置为1-200，下游结合位置为2689+200到2889；修改相应的产物大小。
选择数据库和物种。
5得到了10对引物序列，我们要选择结合位点好，GC含量适当的引物，3’末端是A或者T的引物最好不要选择。
新建一个空白Word文档，按照下列格式将所有引物序列粘贴到Word中。
打开gramene，点击“Blast”，将上述序列粘贴到指定位置。
网址：/选择物种，修改E值。
点击“run”，一切都搞定，选择我们需要的引物，可以无忧无虑的做PCR了。
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Primer Premier 5.0使用介绍(1) Load sequence Preimer Premier 启动界面
基本信息
Original sequence
Sequence name
Choose a function
ห้องสมุดไป่ตู้
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a
一般原则
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%， 过高或过低都不利于引发反应。上下 游引物的GC含量不能相差太大。
不同的算法推荐45-55%或50-60%
一般原则
5. ∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由 能，该值反映了双链结构内部碱基对 的相对稳定性。应当选用3’端∆G 值 较低（绝对值不超过9），而5’端和 中间∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的∆G 值过高，容易在错配位点 形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 （能值越高越容易结合）
引物设计的原则
引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚 体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体因素
如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部 稳定性(internal stability, 用∆G 值反映 )，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹 结构（duplex formation and hairpin）的 能值，在错配位点（false priming site） 的引发效率，引物及产物的GC 含量（ composition），等等。必要时还需对引物 进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进 突变等。
Primer Premier 5.0 的使 用技巧简介
主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
简并引物设计
根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密
码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear） 2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion） 3、支原体（Mycoplasma） 4、植物线粒体（Plant Mitochondrion） 5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion） 6、一般标准（Standard） 7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion） 8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
引物设计界面 First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
一般原则
6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶 切位点，应根据下一步实验中要插入 PCR 产物的载体的相应序列而确定。
一般原则
7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。
常用的引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
一般原则
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp ，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物 长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存 在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个 长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点 只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用 于产生一些突变位点
PCR引物设计
引物设计是PCR 技术中至关重要的一 环。使用不合适的PCR 引物容易导致 实验失败：表现为扩增出目的带之外 的多条带（如形成引物二聚体带）， 不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引物，也可以在本地计 算机上运行引物设计专业软件。
引物设计部分使用说 明初学者超级推荐
主要内容
背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍
PCR
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体 外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复性好、易自动化等突 出优点；能在一个试管内将所要研究的目的 基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万 乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可 从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增 出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
Tm值的计算 一般的公式
Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 对于长一些的引物可用更为准确的 nearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）
一般原则
1. 2. 引物序列在模板内应当没有相似 性较高，尤其是3’端相似性较高的 序列，否则容易导致错配。引物3’ 端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
一般原则
3，引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位 碱基在错配位置导致不同的扩增效率 ，末位碱基为A 的错配效率明显高于 其他3 个碱基，因此应当避免在引物 的3’端使用碱基A。另外，引物二聚 体或发夹结构也可能导致PCR 反应失 败。5’端序列对PCR 影响不太大， 因此常用来引进修饰位点或标记物。