PCR引物设计及软件使用技巧

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第(卷
致不同的扩增效率， 末位碱基为 ! 的错配效率明显 （ ） 。 “ $>;/6;> ” 还具 有同 源性 分析 功能 高于其他 " 个碱基， 因此应当避免在引物的 "’ 端使 ［"， #］ 用碱基 ! 。另外， 引物二聚体或发夹结构也可能 （ ） ， 但并非 其特长， 在 此略过。此 外， 该软 导致 $%& 反应失败。’’ 端序列对 $%& 影响不太大， ［( ］ 件还有一些特殊功能， 其中， 最重要的是设计简并引 因此常用来引进修饰位点或标记物 。 物， 另外还有序 列 “朗读” 、 BC! 与蛋 白序列的互换 （#） 引物序列的 )% 含量一般为 #*+ , -*+ ， 过 高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 )% 含 （ ） 、 语音提示键盘输入 （ ） 等等。 ［(］ 量不能相差太大 。 有时需要根据一段氨基酸序列反推到 BC! 来 （’） 引物所 对应模板位置序列的 ./ 值在 0(1 设计引物， 由于大多数氨基酸 （(* 种常见结构氨基 左右可使复性条件最佳。 ./ 值的计算有多种方法， 酸中的 OI 种） 的遗传密码不只一种， 因此， 由氨基酸 如按公式 ./ 2 # （ ) 3 %） （ ! 3 .） ， 在 45678 软件中 3( 序列反推 序列时， 会遇到 部分 碱基的 不确定 BC! ［’ ］ 使用的是最邻近法 （9:; <;=>;?9 <;67:@8> /;9:8A） 。 性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混 （-） 该 !) 值是指 BC! 双链形成所需的自由能， 和物， 它们的序列组成大部分相同， 但在某些位点有 值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当 所变化， 称之为简并引物。遗传密码规则因物种或 选用 "’ 端! ) 值较低 （绝对值不超过 D ） ， 而 ’’ 端和 细胞亚结构的不同而异， 比如在线粒体内的遗传密 中间 ! ) 值相对较高的引物。引物的 "’ 端的 ! )值 码与细 胞核是不 一样的。 “ $>;/6;> ” 可以针 对模板 过高， 容易在错配位点形成双链结构并引发 BC! 聚 BC! 的来源以相应的遗传密码规则转换 BC! 和氨 ［-］ 合反应 。 基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传 （0） 引物二聚体及 发夹结构的能 值过高 （超过 密码 规 则 供 用 户 选 择，有 纤 毛 虫 大 核 （ %656=9; ） 易导致产生引物二聚体带， 并且降低引 #E ’FG=5 H /85 ） 、 无脊 椎动物线 粒体 （ Q=G>8<MG5;=> K<R;>9;@>=9; Q698S ［-］ 物有效浓度而使 $%& 反应不能正常进行 。 、 支原体 （ QTG8U5=?/= ） 、 植物 线粒体 （ $5=<9S G:8<A>68<） （I） 对引物的修饰一般是在 ’’ 端增加酶切位点， 、 原生动物 线粒体 （ $>898V8=< Q698G:8<S Q698G:8<A>68<） 应根据下一步实验中要插入 $%& 产物的载体的相 、 一般标准 （ L9=<A=>A） 、 脊椎动物线粒体 （ J;>9;S A>68<） 应序列而确定。 @>=9; Q698G:8<A>68< ） 和酵母线粒体 （ W;=?9 Q698G:8<A>6S 值得一提的是， 各种模板的引物设计难度不一。 8<） 。 有的模板本身条件比较困难， 例如 )% 含量偏高或 (EO E ( 使用步骤及技巧 “ $>;/6;> ” 软件启动界面如 偏低， 导致找不到各种指标都十分合适的引物； 在用 图 O。 作克隆目的的 $%& 因为产物序列相对固定， 引物设 其主要功能在主界面上一目了然 （按钮功能如 计的选择自由 度较低。在这 种情况只能 退而求其 上述） 。限制性酶切位点分析及基元查找功能比较 次， 尽量去满足条件。 简单， 点击该功能按钮后， 选择相应的限制性内切酶 或基元 （如 X O* 序列， ， 按确 定即可。 X "’ 序 列等） ( 引物的自动搜索和评价分析 常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还 可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。 软件的引物设计功能主要体现在两个方面： 首 进行引物设计时， 点击 按钮， 界面如图 先是引物分析评价功能， 该功能只有少数商业版软 件能够做到， 其中以 “ 45678-” 最优秀； 其次是引物的 (。 自动搜索功能， 各种软件在这方面的侧重点不同， 因 进一步点击 按钮， 出现 “ ?;=>G: G>69;>6=” 此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验， 自 有多种参数可以调整。搜索目的 （ L;=G: Y8>） 动搜索功能以 “ $>;/6;> $>6/;> ” 为最强 且方便使用， 窗口， 有三种选项， $%& 引物 （ $%& $>6/;>? ） ， 测序引物 （ L;S 其他软 件如 “ J;G98> C.K LM69” 、 “ B<=?6? ” 、 “ 4/67= ” 和 ZM;<G6<7 $>6/;>? ） ， 杂交探针 （ [T@>6A6V=968< $>8@;?） 。 “B<=?9=>” 都带有引物自动搜索功能， 但搜索结果不 搜索类型 （L;=>G: .TU; ） 可选择分别或同时查找上、 下 是十分理想。要想得到效果很好的引物， 在自动搜 游引物 （ L;<?; H !<96 X ?;<?; $>6/;>， 或 \89: ） ， 或者成对 索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计 查找 （ ） ， 或 者分 别 以 适 合 上、 下 游引 物为主 $=6>? 软件的最 佳搭配是 “ 45678 ” 和 “ $>;/6;> ” 软件 合并使 。另外还 用， 以 “ $>;/6;> ” 进 行自动搜 索， “ 45678 ” 进行 分析评 （%8/U=96@5; ]69: L;<?; H !<96 X ?;<?; $>6/;> ） 可改变选择 区域 （ ） ， 引 物长度 （ $>6/;> L;=>G: &=<7;? 价， 如此可快速设计出成功率很高的引物。 ） ， 选择 方式 （ ） ， 参数 选择 （ L;=>G: ^;<79: L;=>G: Q8A; (N O $>6/;> $>;/6;> ’E * 的使用技巧简介 $=>=/;9;>?） 等等。使用者可根 自己的需要设定各 “ $>;/6;>” 的主要功能分四大块， 其中有 (E OE O 功能 项参 。如果没 有特殊要 求， 建 议使用默 认设置。 三种功能比较常用， 即引物设计 （ ） 、 限制性 然后按 ， 随之出现的 L;=>G: $>87>;?? 窗口中 内切酶位点分析 （ ） 和 BC! 基元 （ /896P） 查找
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自从 $8:+ 年 X<’C>YG--*I 发明了聚合酶链式反应 具体实现 这 7 条基 本原则需 要考虑 到诸多因 （!"#） 以来， 素， 如引物长度 （ S’*)(’ -(C/D@） ， 产物 长 度 （ S’0TGED !"# 技术已成为分子生物学研究中使用 ［$］ 最多、 最广泛的手段之一 ， 而引物设计是 !"# 技术 ） ， 序列 值 （ ） ， 引物与模板 -(C/D@ 9) )(-D*C/ D()S(’<DG’( 中至关重要的一环。使用不合适的 !"# 引物容易导 形成双链的内部稳定性 （ *CD(’C<- ID<H*-*D> ， 用! N 值反 致实验失败： 表现为扩增出目的带之外的多条带 （如 映） ， 形成引物二聚体 （ S’*)(’ T*)(’） 及发夹结构 （ TG. 形成引物二聚体带） ， 不出带或出带很弱， 等等。 的能 值， 在错配 位点 （ R<-I( S-(= R0’)<D*0C <CT @<*’S*C） 现在 !"# 引物设计大都通过计算机软件进行。 S’*)*C/ I*D( ） 的 引 发效 率， 引 物 及 产物 的 N" 含 量 ， 等等。必要时还 需对引物进行修饰， 可以直接提交模板序列到特定网页， 得到设计好的引 （E0)S0I*D*0C） 引进突变等。根据有关 物， 也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 如增加限制性内切酶位点， 参考资料和笔者在实践中的总结， 引物设计应注意 一般来说， 专门进行 !"# 引物设计的专业软件功能更 如下要点： 为强大， 但使用起来却不太容易。本文将就引物设计 （$） 引物的长度一般为 $+ [ 7%HS， 常用的是 $: [ 原则及软件使用问题进行探讨。 但不应大于 7:HS， 因为过长会导致其延伸温度 &5HS， ［&］ 大于 53\ ， 不适于 9<F ZML 聚合酶进行反应 。 $ 引物设计的原则 （&） 引物序列在模板内应当没有较高相似性片 段， 尤其是 7’ 端相似性较高的序列， 否则容易导致 引物设计有 7 条基本原则： 首先引物与模板的 错配。引物 7 ’ 端出现 7 个以上的连续碱基， 如 NNN 序列要紧密互补； 其次引物与引物之间避免形成稳 ［&］ 或 """ ， 也会使错误引发机率增加 。 定的二聚体或发夹结构； 再次引物不能在模板的非 （7） 引物 7’ 端的末位碱基对 9<F 酶的 ZML 合成 目的位点引发 ZML 聚合反应 （即错配） 。 效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导