应用微生物第一章 第三节 微生物胞外多糖及其应用

(5). pH值的变化
(6). 物质消长变化规律综合分析。
真实反应菌体细胞生长、代谢与环境相互关系的规律
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() (g/L)
三、微生物多糖发酵研究
pH 7 6 5
V 9000 (CP)
7000
产 量 27
21
pH
菌体蛋白 粘度
5000 15
产量
菌
体
蛋
玉
0.5 白
米
（
淀
％
粉 4 0.4 ）
％
3 0.3
4、质量标准
GB:食品添加剂黄原胶 粘度（CP）1％水溶液 剪切性能值6rpm.V/60rpm.V 干燥比重（％） 灰分（％） 总N含量（％）
≥600 ≥6 ≤13 ≤13 ≤1.5
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三、微生物多糖发酵研究
砷（As）含量（ppm）
≤3
重金属（以Pb计，ppm）
≤10
微生物指标
细菌总数（1g粉状产品）
螺旋共聚体———双股螺旋———不规则线团 29
黄原胶的优良性能 （3）乳化性，悬浮颗粒性
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黄原胶的优良性能 （4）持水性
（5）稳定性（耐温，抗盐）
--
Na+，K+，Mg2+，Ca2+
- - - COOCOO-
（6）成凝胶性
+ Cr3+
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四、微生物胞外多糖广泛应用
(1).食品工业应用 冰激凌等冷冻食品 烘烤食品 果冻、果浆食品 饮料、食品保鲜
升温、高剪切
螺旋共聚体
降温、低剪切
双股螺旋
不规则线团
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黄原胶的优良性能 （1）增黏性
粘浓曲线
黄原胶溶液具有一定黏度，并在一定条件下随溶液浓度增 加而增大。
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黄原胶的优良性能 （2）剪切稀释性、触变性
粘剪曲线
剪切稀释性——表观粘度随着剪切速率的增加而降低的特性 触变性——由于剪切作用造成黏度降低的自行恢复能力 本质是由黄原胶分子构型的变化所决定的：
3
1、微生物胞外多糖
目前主要研究方向 1、胞外多糖生理合成与调控研究 2、胞外多糖合成遗传学研究 合成基因大片段定位在染色体上 3、多糖分子结构与功能 一级结构、高级结构决定性能 4、工业应用 建筑 石油 5、免疫激活功能 灵芝多糖、香菇多糖、小核菌多糖的三股螺旋结构有 免疫激活功能 干扰素的诱生剂，使抑制基因去抑制 干扰素半衰期短 抗病毒、抗肿瘤的药物
(2) 24小时后菌体平衡生长，残余淀粉用于黄原胶合成，产 量、粘度剧增，72小时发酵终止。
(3) 采用流加补充底物(淀粉、Glc或蔗糖)和氨水调节pH7.0， 可进一步促进分批发酵过程中的黄原胶合成。
3、黄原胶分离纯化
分离原理与方法
(1).乙醇、丙酮沉淀法 国内外常用方法，纯度高，溶剂回收是技术与成本的关 键
4
2、产生胞外多糖的微生物类群
目前自然界发现有100多种微生物产胞外多糖 主要是细菌：
Xanthomonas sp.(黄单胞菌属) Leucostoc sp.(明串珠菌属) Azotobacter sp.(固氮菌属) Rhizobium sp.(根瘤菌属) Sphingomonas sp.(鞘胺醇单胞菌属)
Glc 支链：α-1.3链 Glc
分子量:数千万
（2）.Pullulan（普鲁兰）
产生菌：出芽 梗霉
α-1.4
[ 重复单位结构
Glc
Glc
分子量：4×104——2×106
Glc ]n
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四、微生物胞外多糖的分子结构与性质
（3）.cleroglucan(核菌葡聚糖) 产生菌:葡聚糖小核菌 糖基单体：β－D－Glc 重复单位结构
生物技术专业《应用微生物学》课程
第一章 微生物在工业领域中的应用
第三节 微生物胞外多糖及其应用
1
一、微生物胞外多糖概述
2
1、微生物胞外多糖
胞壁多糖
肽聚糖、脂多糖
胞内多糖
糖原
胞外多糖（Extracellular polysaccharides）
分泌或扩散到细胞以外的多糖
荚膜
黏液层 最具开发利用价值的多糖
C55-Lipid-PP 无运载活性
C55-Lipid-P焦磷酸 化酶
C55-Lipid-P 有运载活性
影印 C55-Lipid-P含量高
含杆菌肽？
不长菌落（C55-LipidP含量低）
小菌落(C55-LipidP含量高)
杆菌肽Bacitrain
在高浓度杆菌肽平板上长出的菌落C55-Lipid-P含量高
筛选淀粉酶活性高的菌株，检测黄原胶合成速率和产量 10
二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
2)、C55-Lipid-P糖基载体脂运载功Leabharlann Baidu的调节
共利用调节：X. campestris NK-01，G-
脂多糖、肽聚糖、黄原胶合成皆以C55-Lipid-P为糖 基载体
LPS合成
pep合成
C55-Lipid-P
(1). 最佳培养基的确立
单因子试验
多因子多水平正交试验
均匀设计实验 计算机软件的应用
(2). 最佳环境因子的选择
(3). 营养因子。环境因子多因素。多水平均匀设计最佳选择
2、最佳培养条件下物质消失变化的规律
(1). 发酵过程中菌体细胞数量变化
(2). 底物消长变化
(3). 产物消长变化
(4). 发酵液粘度变化
pyr含量越高，剪切稀释性能越好 分子量2－5×106
（产5）生. 菌Ba：cte棕ri色al 固alg氮in菌ate（细菌藻A朊|c酸） 糖基单体：ManA,GulA 非糖基组分：Ac 分子结构……ManA－GulA－ManA
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四、微生物胞外多糖的分子结构与性质
（6）.Colanic acid（肠细菌酸性多糖） 产生菌：大肠菌群 糖基单体：Glc，Gal，Fuc，GlcA 非糖基组分：Ac 重复单位结构： Pyr＝Gal | GlcA | Gal Ac ||
“五糖重复单元” 侧链残基被乙酰化或丙酮酰化 不同菌株和不同条件所产的黄原胶存在异同
7
二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
1、依赖于糖基载体酯(C55-Lipid-p)的合成模式
糖基载体酯（C55-Lipid-P）十一聚类异戊二烯醇磷酸酯， 其功能是将胞质内的糖基聚合成多糖，并通过细胞膜运往胞 外，因此它是控制多糖分子合成、运输与分泌的载体。
[-Glc-Glc-]n Man-Ac
GlcA Man=pyr
淀粉酶
UTP-Glc焦 磷酸化酶
GTP-Man焦 UDP-Glc 糖基载体酯 特异糖基 磷酸化酶 脱氢酶 焦磷酸化酶 转移酶
多糖聚 乙酰基转 丙酮酸转
合酶 移酶
移酶
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二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
黄原胶是依赖于C55-Lipid-P生物合成模式的典型代表。 黄原胶合成生理调控核心步骤：
糖基载体酯的科学研究 功能调节、运载活性、提高产量
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二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
胞内
HMP途径
Me胞m膜brane
胞壁
胞外
葡萄糖-1-磷酸 葡萄糖-6-磷酸
GTP
UTP
PP
PP
葡萄糖 C55-Lipid-pp
葡萄糖
玉米淀粉
GDP-Man
UDP-Glc
UDP-GlcA
Ac Pyr
p + C55-Lipid-p
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二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
2、不依赖于C55-Lipid-P糖基载体合成模式
肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)厌氧条件下 合成右旋糖酐(dextrans)即属该合成模式
(1). dextrans生物合成显著特点
1). 菌体生长和dextran生物合成以蔗糖为特异性底物； 2). 蔗糖诱导菌体细胞产生葡聚糖-蔗糖酶(胞外酶)； 3). 蔗糖做底物不进入菌体细胞。在胞外水解成葡萄 糖 和
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五、微生物胞外多糖的分子构型与性质
黄原胶的分子构型
一级结构：
黄原胶分子主链以β-1.4键构成纤维素骨架的线性结构， 侧链含羧酸带负电荷，反向缠绕主链，呈锯齿状
二级结构：
两条线性黄原胶分子靠氢键维系成右手双股螺旋结构
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三级结构：
双股螺旋结构间靠微弱的非共价键结合，排列成螺旋共聚体
黄原胶分子构型的变化：
Xanthan gum
C55-Lipid-P共利用顺序：
先用于胞壁多糖合成，后用于胞外多糖合成。
先长细胞，后合成胞外多糖
Xanthan gum是次生代谢产物还是初级代谢产物？
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二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
3）运载活性的调节
C55-Lipid-PP
载体脂焦磷酸化酶
无活性
C55-Lipid-P＋P 有活性
引物
胞壁多糖或胞外多糖
载体脂焦磷酸化酶：最适pH7.0
黄原胶发酵液pH5.0以下，终止合成
流加NH4Cl，调pH7.0，促进黄原胶合成
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二、微生物多糖的合成模式和生理学调控
4）筛选C55-Lipid-P含量高的菌株
C55-Lipid-P含量高的菌株——杆菌肽高抗性菌株的选 育（杆菌肽与C55-Lipid-P有很高的亲和力）。
[ Glc
β-1、4键
Glc Glc ] n
Glc β-1、6键
（4）.Xanthan（黄原胶） 产生菌：X.Campestris（野油菜黄单胞菌） 糖基载体：Glc，Man，GlcA 非糖基组分：Ac，Pyr 重复单位结构
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β-1、4键
[ Glc Glc ] n
Man-Ac GlcA
Man=pyr(并非皆有pyr)
(2).非食品工业 制药、印染、纺织、造纸、搪瓷、 炸药、农药喷洒、建筑材料、墨水等
(3).油田开发 油田钻井泥浆、压裂液、固井液、 注水采油增粘剂、注入调剖剂、大 孔道封堵剂
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胞外多糖在矿物加工工程中的研究和应用
硫化矿的浮选中的抑制剂，其基本思路是以细菌胞外聚合物替代 金属盐类和氰化物，这样不仅可以获得较好的经济效益，而且还 可解决使用金属盐类和氰化物带来的环境污染问题。很多研究者 借鉴环境领域中有关利用细菌胞外聚合物处理重金属废水的研究 成果，在矿物浮选过程中将胞外聚合物作为生物絮凝剂。索马桑 达兰等指出，细菌及胞外聚合物可增强方解石的絮凝。
果糖，果糖进入细胞作碳源和能源，葡萄糖在胞外聚合 成右旋糖酐。
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蔗糖 n蔗糖
诱导
葡聚糖蔗糖酶
合 成
厌 氧
细 胞 物
代 谢
Gru
质
分解
n果糖
α－葡 聚合
能量
6 α－葡
3
1
6 α－葡
α－3 葡
α1－葡
6
dextrans
细胞生长和dextrans合成同时进行，不进入细胞
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三、微生物多糖发酵研究
1、培养条件优化研究
≤10000
霉菌总数（1g粉状产品）
≤300
致病菌
Coliform
不得检出
Salmonella
不得检出
S.aureus
不得检出
P.aeruginosa
不得检出
X.campestris
不得检出
未列入标准
丙酮酸含量（％）
≥1.5
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四、微生物胞外多糖的分子结构与性质
1、几种重要的胞外多糖分子组成
（1）.Dextrans(右旋糖酐) 产生菌:肠膜状明串珠菌 糖基单体:α-D-Glc 分子结构 Glc Glc Glc Glc
1）胞外淀粉酶活性高低对黄原胶合成的影响 X.Campestris NK-01以玉米淀粉为碳源
淀粉酶
玉米淀粉
Glc
进入细胞
淀粉酶是控制底物进入细胞的“闸门”
淀粉酶活性是碳源利用效率的关键
高淀粉酶活性菌株筛选：
加碘液 证明是淀粉
水解圈
N.K-01细胞 诱变
R水解圈(mm) R菌落(mm)
比值大
玉米淀粉平板
(2).钙盐沉淀法 Ca离子与羧基结合，碱性条件下沉淀
COO－ －OOC Ca++ Ca++ (OH)2
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三、微生物多糖发酵研究
碱性条件下钙盐浓缩黄原胶分子 用酸醇处理脱钙，黄原胶分子才溶于水 成本低，水溶性差
(3).喷雾干燥法 纯度低，水溶性差
(4).滤膜超滤技术 用滤膜浓缩，再用少量乙醇沉淀 滤膜质量
有色金属的湿法浸出及从有色金属废渣中回收重金属的研究，基 本思路是吸附至矿物表面的细菌被自身产生的EPS所包裹，而 EPS又介导了细菌与硫化矿物能源的接触，在生物膜的形成和细 菌- 基质的界面作用中起着重要作用。菌表面的脂类、多糖和蛋 白质等物质形成的EPS是细菌真正的功能表面，在细菌与矿物之 间的复杂界面作用中起着极其重要的作用。
有少数真菌：
Sclerotium sp.(小核菌属) Rhodotorula sp.(红酵母属)
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野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）
粘稠、光滑的黄色菌落 培养液呈粘稠胶状 光学显微镜下包裹荚膜状物质 电镜下分泌丝状多糖 产生黄原胶
6
黄原胶（Xanthan gum）
[ Glc－Fuc－Fuc ] n
大肠菌群细胞表面多糖抗原成分，不能作为商品
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四、微生物胞外多糖的分子结构与性质
（7）. 结冷胶
天然结冷胶的分子结构
结冷胶主链结构是葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖以2∶1∶1摩尔比聚合而 成的四碳重复单元的长链分子。天然结冷胶与低乙酰基结冷胶在结构上的 不同点在于：前者在第一个葡萄糖分子C2 处被甘油酸酯化, C6处被乙酸酯 化。
3000 9
2 0.2
1000 3
残余淀粉
1 0.1
0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 X.Campestris.N.K-01 1200L罐黄原胶发酵过程中代谢变化 17
综合分析：
(1) 24小时前菌体细胞生长，大量消耗玉米淀粉作碳源， pH下降，黄原胶不合成，发酵液无粘度