第3章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定

（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法)
4 备注 （1）在偶氮磺酸染料中，除橘黄G外，也可以 使用酸性橙12(Acid Orange l2，缩写AO l2， 分于量305.37)，它的分子结构与橘黄G基本相 同，也含有一个偶氮发色基团，但只有一个磺 酸基，即一个结合碱基的位置(橘黄G二个)， 后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是橘黄 G的2倍。故其更适合于在染料结合法中应用， 它们在482nm左右有一个较宽的吸收峰，便于 比色测定。
消煮液中硫酸铵加碱蒸馏，使氨逸出，以硼酸吸 收之，然后用标准酸液滴定之。 蒸馏过程的反应： (NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH3+2H2O NH3+H2O→NH4OH NH4OH+H3BO3→NH4·H2BO3+H2O 滴定过程的反应： 2NH4·H2BO3+ H2SO4→(NH4)2SO4+ 2H3BO3 ③用滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红色。记录所用 酸标准溶液的体积（mL）。空白测定所用酸标准溶 液的体积，一般不得超过0.4mL
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 3 操作步骤 （2）样品的测定。称取通过0.25mm筛子的 谷物样品200～700mg，放人30mL试管中，加入 lmg·mL-1染料溶液20mL，盖紧试管口，在水平振 荡器上振荡60min，使样品和染料溶液充分反 应，取反应后的浑浊液(8～10mL)注入离心管 中，以3 000r／min的速度离心8～12min，至上 部溶液澄清为止，以下操作步骤同标准曲线。 求出反应后染料溶液的浓度。 据反应前后溶液中染料浓度的变化，可 计算出样品的染料结合量。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 3 操作步骤 (3) 回归方程。选取粗蛋白质含量从低到高(如小 麦种子粗蛋白质含量可以从7.0％～17.0%)的 同一类谷物样品35个左右，用开氏法测其粗蛋 白质含量(％)，并用上述方法测定各样品的染 料结合量。根据所得的结果，计算 出染料结合 量与蛋白质含量(％)之间的回归方程。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 以定量蛋白质为目的的总氮量测定中，开氏法 分解时，硝态氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬 菜类特别是可能含有硝态氮的化合物的样品，需要 用水杨酸固定硝态氮化合物，用开氏分解测定总氮 量，同时用离子电极法测定硝态氮的含量，再从总 氮量减去硝态氮量后乘以蛋白质换算系数即得蛋白 质含量。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 3 说明 (2) 称样量的大小取决于样品的含氮量。若含氮为 1.0％～5.0％，称样量为0.30g，可根据含氮量 的水平适当增减称样量。 (3)在消煮过程中须经常转动开氏瓶，使喷溅在瓶 壁上的样品及早回流至硫酸溶液中，特别是开始 消煮后不久，会有大量气泡向上逸，不宜升温过 快，以防溢出。
N = N×6.25 = 蛋白质含量 16%
不同种类食品的蛋白质系数不同：玉米，荞麦，青 豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品 为6.38。
牛奶中为何添加三聚氰胺？
C3N3(NH2)3 三聚氰胺含氮量高达66.6%，是牛奶的151倍，是 奶粉的23倍。也称为“蛋白精”白色无味，没有简 单的检测方法 。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 3 操作步骤
（4）计算
B = V
(ρο
− ρ
)/
m
式中：B——每克样品所结合的染料的毫克数(mg·g-1)； V——加入染料溶液的总体积(mL)； P0——染料溶液的初始浓度(mg·mL-1)； P——染料结合反应后残余溶液中染料浓度(mg·mL-1)； m——样品的质量(R)。 样品的蛋白质含量(％)。将样品的DBC值(即“B”值)代入 回归方程，计算样品蛋白质的含量。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 3 操作步骤 （1）标准曲线制作。与样品测定的同时，取1.000 g·L-1的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放人 100mL容量瓶中，用水定容，即得浓度系列为0.1、 0.3、0.5、0.6、0.7、0.8g·L-1的染料标准溶液，用 GXD-201型蛋白质分析仪测透光率(T)，并用半对 数坐标纸上绘制浓度-透光率(T)值的标准曲线。如 无该型号的蛋白质分析仪，也可以把残余的染料 溶液用水稀释50倍后，用0.5cm比色杯和482nm的 波长，在721分光光度上测定吸收值(A)绘制浓度吸收值标准曲线。
消煮方式（通风橱） 铝块消煮器、远红外消煮器、封管消煮器……
蒸馏装置图
全自动凯氏定氮仪
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 2 操作步骤 (1) 样品的消煮。称取烘干样品(过0.25mm筛) 0.3000 ~ 0.5000g置于50mL或100mL开氏瓶或消煮 管中，加入混合催化剂1.8g，加几滴水湿润后， 加5mL浓H2SO4，小心轻摇后(最好加塞放置过 夜)，盖上小漏斗，将消煮管放置在消煮炉或电炉 上，开始时用小火加热，待消煮液呈棕色时，可 提高温度，消煮至溶液呈清亮带浅蓝色时，再加 热约10min，取下冷却至温热时，将消煮液无损地 转入100mL容量瓶中，冷却至室温后定容并放置 澄清。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 1 方法特点 该法是间接测定种子中蛋白质的方法。方 法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准 确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国 谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量 的正式方法。有据此方法原理而设计的蛋白质 分析仪。这里必须指出该法对随意混合物的样 品不适用。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 4 备注 （2）样品称样量按蛋白质含量的高低而定。 水稻、小麦、大麦等可称取500mg，玉米称取 700mg，大豆称取200mg，花生及鱼粉等可少一 些。 （3）染料结合反应的条件，如染料的pH、样 品的粒度、振荡反应的时间和温度等影响到测 定结果，故应力求每次测定的反应条件一致， 特别是测定样品与测定回归方程的样品时的反 应条件一致。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2 操作步骤 (1)样品的测定。准确称取过60目筛的样品 0.050～0.100g(含蛋白质在1～15g·L-1范围内)， 放人干燥试管中，再用移液管加入10mL双缩 脲试剂，充分搅拌，于40℃水浴放置15min， 并经常搅拌。然后过滤或用4 000r·min-1离心 10min，取清液用550nm波长比色，从标准回 归方程查得蛋白质含量。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 1 方法原理
蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)的-NH2、 咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在pH=2～3的酸性缓冲 液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘 黄G、酸性橙12等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质-染料 络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知 浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品 的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。染料结合 量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。 在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中蛋白质的含 量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。
该法为美国谷物化学协会(AACC)测定谷物蛋白质的正式 方法，且已有据此法原理为基础的快速测定蛋白质的自动 分析仪。 一般的生化分析中采用的双缩脲试剂是碱性硫酸铜水溶 液，不适用于种子蛋白质的分析，因为它不稳定，而且会 浸出有色物质、脂肪及一些淀粉物质，干扰比色测定。而 异丙醇双缩脲试剂，可以减少这些物质的溶解，排除干扰。 本法对温度及时间的要求严格，否则再现性不高。采用室 温20-25℃，须于120～190min内比色；40℃为15-70min显 色稳定；而在60℃连续振荡条件下显色，则反应时间缩短 为5min。 离心须用6 000r·min-1，10min可得澄清液，小于4000r·min-1 的效果不佳。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2 操作步骤
(2)标准回归方程的测定。分别称取0.050 0～0.120 0g待测定谷物样品20--30个(也 可用蛋白质含量差异大的样品30个左 右)，先用开氏法测出具蛋白质的含量， 然后按上法显色并测定吸收值A，作出标 准回归方程。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 3 备注
NH2 C O NH2 NH2 加热 1 8 0 o C C O NH 2 C
NH2 O NH O NH 2
紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：
+NH 3
C
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 1 方法原理 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，实验证明，蛋 白Βιβλιοθήκη Baidu溶液浓度在1-15mg之间，其呈色溶液的吸收值 与蛋白质含量成正比关系。故可用此反应进行蛋白 质的测定。（ 560nm） 测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。 样品不用消化。
（二）同类种子中蛋白质的测定(染料结合-DBC法) 1 方法原理
定量：如果要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质
的含量，则需用开氏法测定同类种子的一批样品的粗 蛋白质的质量分数，同时也用染料结合法测定其染料 结合量，然后求出粗蛋白质含量(％)对染料结合量的 回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染 料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗 蛋白质(％)含量。 定性：若只需比较蛋白质含量的高低，如在筛选 同种作物种子的大批样品时，不必知道蛋白质的绝对 含量，只要测定样品的染料结合量即可进行比较。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 主要仪器 恒温水浴锅、离心机、721型分光光度 计。 试剂 双缩脲试剂。在500mL容量瓶中依次加入 下列溶液: 40g·L-1CuSO4 30mL，25g·L-1酒石酸钾钠 100mL，再缓慢加人5mol·L-1 KOH30mL，用去 离子水定容。使用时将此溶液与等体积透明的异 丙醇混合。若溶液中出现浑浊或沉淀，则不宜使 用。
第三章 蛋白质 和主要必需氨基酸的测定
一、概述
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很 大。主要由C、H、O、N、S五种元素组 成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、 Fe、I 等。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 1 方法原理 一 些蛋白质的含氮量一般为 15%~ 17.6%，有的 上下浮动。开氏法可以测出总氮 N
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 2. 方法特点及应用范围
本法须用开氏法作标准回归方程。本法灵 敏度较低但经试验其与开氏法的相关性较 好，操作简单快速，适用样品广泛，在生物 化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本 法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及 肉类等样品测定，尤适用于大批品种选择用。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 2 操作步骤 （2）氮的测定。用移液管吸取澄清待测液5.00或 10.00mL放入半微量定氮仪中进行定氮。同时作空 白试验。
（一）籽粒中粗蛋白质的测定
H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 3 说明
（1）本法测定的结果为粗蛋白质的含量。如要测 定纯蛋白质的含量，则样品应先用蛋白质沉淀剂 碱性硫酸铜、碱性醋酸铅、200g·L-1 - 250g·L-1单 宁或100g·L-1三氯乙酸等处理，将蛋白质从水溶 液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋 白质的换算系数即可得：“纯蛋白质”量。
（三）同类种子中蛋白质的测定(双缩脲法) 1 方法原理 尿素NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时，两分子 缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这 种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）