蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
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演示文稿第八章蛋白质和氨基酸的测定(优秀文档)PPT
应用
• 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多 非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广 泛应用于食品体系。
• 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法更 适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂 （如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键 在190nm~220nm处的紫外吸收比在280nm更强，但在 低紫外区域的测定更困难。
• 灵敏
• 准确
• 快速
• 样品用量少
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三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏
定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常
量法 • Page 160
当前23页，共109页，星期日。
蛋白质的快速测定－双缩脲法
装置
当前14页，共109页，星期日。
操作步骤
消化
准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液 体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细的硫酸 铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→安装消化装 置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的 石棉网上→用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡 沫停止后→加大火力保持瓶内液体微沸→至液体变蓝 绿色透明→继续加热微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
• 因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋白质 的生物化学中。然而，一般不用于测定未从食品混 合物中纯化的蛋白质。
1．非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50~100倍。
B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。 2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。 3．特异性要高于其他大多数方法。 4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。
• 简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多 非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广 泛应用于食品体系。
• 已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法更 适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂 （如8M尿素）中的蛋白质测定。尽管蛋白质中的肽键 在190nm~220nm处的紫外吸收比在280nm更强，但在 低紫外区域的测定更困难。
• 灵敏
• 准确
• 快速
• 样品用量少
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三、微量凯氏定氮法
• 原理及适用范围同常量凯氏定氮法 • 主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏
定氮仪 • 试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常
量法 • Page 160
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蛋白质的快速测定－双缩脲法
装置
当前14页，共109页，星期日。
操作步骤
消化
准确称取固体样品0.2～2g（半固体样品2～5g，液 体样品10～20ml）→移入凯氏烧瓶→加入研细的硫酸 铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml→摇匀→安装消化装 置→于凯氏瓶口放一漏斗→以45°角斜支于有小孔的 石棉网上→用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡 沫停止后→加大火力保持瓶内液体微沸→至液体变蓝 绿色透明→继续加热微沸30分钟→冷却→ 定容。 加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。
• 因为福林酚法简单、灵敏，已被广泛应用于蛋白质 的生物化学中。然而，一般不用于测定未从食品混 合物中纯化的蛋白质。
1．非常灵敏： A:较双缩脲法灵敏50~100倍。
B：较280nm紫外吸收法灵敏10~20倍。 C：较茚三酮法灵敏好几倍。 D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。 2．测定结果较少受到样品混浊度的影响。 3．特异性要高于其他大多数方法。 4．操作相对简单，可以在1~1.5小时内完成。
食品分析课件6.蛋白质及氨基酸的测定
趋势分析
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污
对连续测定结果进行趋势分析，了解变化趋势。
数据可靠性评估
1 2
重复性检验
通过多次重复测定，评估测定方法的重复性。
准确性检验
通过与其他已知准确度高的方法进行比较，评估 测定方法的准确性。
3
检出限和精密度
根据方法检出限和精密度，评估数据可靠性。
06
实际应用与案例分析
食品营养标签的制定
蛋白质含量
在食品生产过程中，蛋白质含量的均匀度是评价产品质量的重要指标之一。通过 测定不同批次或不同部位食品中的蛋白质含量，可以了解产品的均匀度，从而控 制产品质量。
氨基酸比例
氨基酸比例是评价食品质量的重要参考指标。不同食品中的氨基酸比例有所不同 ，通过测定食品中的氨基酸比例，可以了解产品的质量，为质量控制提供依据。
05
数据分析与解读
数据处理方法
平均值计算
对多次测定结果取平均值，以减少误差。
异常值剔除
根据统计学原理，将偏离平均值过大的数据剔除。
数据标准化
将不同来源的数据进行标准化处理，以便于比较。
结果解读与比较
正常范围判断
将测定结果与标准值或参考值进行比较，判断是否在正常范围内。
差异分析
对不同样品或不同处理条件下的结果进行差异分析，找出显著性差 异。
操作规范
严格遵守操作规程，避免操作 不当导致实验失败或安全事故
。
数据记录
及时记录实验数据，避免丢失 数据或误差。
安全须知
穿戴防护服
实验过程中需穿戴实验 服和化学防护眼镜等个
人防护用品。
保持通风
保持实验室通风良好， 避免有害气体积累。
废弃物处理
急救措施
按照实验室规定正确处 理废弃物，防止环境污
8蛋白质和氨基酸的测定.ppt
1、硫酸铜 (CuSO4·5H2O)。 2、硫酸钾。 3、硫酸 (密度为1.8419g/L)。 4、硼酸溶液 (20g/L)。 5、氢氧化钠溶液 (400g/L)。 6、盐酸标准滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L] 或
硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L] 。 7、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L) 临用时混合。
分子量 36.5 63.02 100.5 98.0 98.1
含量/(%)(质量分数) 36～38 65～68 70 85 96～98
相对密度 1.18(约)
1.4 1.67 1.70 1.84(约)
浓度/(mol/L) 12(HCl) 16(HNO3)
12(HClO4) 15(H3PO4) 18(H2SO4)
3.难点
1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
§8-1 概述
蛋白质是食品的重要组成成分，蛋白质一
词，在希腊文中是“第一重要”的意思，也就 所谓蛋白质是生命的基础。食品的营养价值的
赖氨酸
高低，主要看蛋白质的高低。除了保证食品的 天冬氨酸
营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构
四、仪器（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
改良式定氮蒸馏器
半微量定氮蒸馏器
§8-2 食品中蛋白质测定—凯氏定氮法
四、仪器（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
§8-2 食品中蛋白质测定—凯氏定氮法
五、试剂（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
O
硫酸标准滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L] 。 7、混合指示液：1份甲基红乙醇溶液 (1g/L) 与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L) 临用时混合。
分子量 36.5 63.02 100.5 98.0 98.1
含量/(%)(质量分数) 36～38 65～68 70 85 96～98
相对密度 1.18(约)
1.4 1.67 1.70 1.84(约)
浓度/(mol/L) 12(HCl) 16(HNO3)
12(HClO4) 15(H3PO4) 18(H2SO4)
3.难点
1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
§8-1 概述
蛋白质是食品的重要组成成分，蛋白质一
词，在希腊文中是“第一重要”的意思，也就 所谓蛋白质是生命的基础。食品的营养价值的
赖氨酸
高低，主要看蛋白质的高低。除了保证食品的 天冬氨酸
营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构
四、仪器（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
改良式定氮蒸馏器
半微量定氮蒸馏器
§8-2 食品中蛋白质测定—凯氏定氮法
四、仪器（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
§8-2 食品中蛋白质测定—凯氏定氮法
五、试剂（GB/T 5009.5-2003《食品中蛋白质的测定》第一法）
O
第八章蛋白质和氨基酸的测定-第一节概述.ppt
第八章 蛋白质和氨基酸的测定 (p114)
第一节 概述
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、 S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无 论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋 白是优良的蛋白质资源。
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算 出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴 定过量的酸。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。
2020-12-1
谢谢你的观赏
15
（1）样品消化： 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化
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17
2、仪器 此法可用于各类食品中蛋白质含量测定，是国家标准方法（GB/T5009.5-1985）。
3、试剂 4、操作方法 取样：固体样品0.2-2g，半固态样2-5g，液体样品10-20ml。 消化剂：硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20ml。 消化结束：液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。 蒸馏：以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 以奈氏试剂〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕
2020-12-1
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10
（二）脂蛋白的显色：
1、苏丹黑显色法： 将0.1g苏丹黑B溶解于煮沸的100ml60％的乙醇溶液中，制备成饱
第一节 概述
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、 S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无 论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋 白是优良的蛋白质资源。
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算 出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴 定过量的酸。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。
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15
（1）样品消化： 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化
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17
2、仪器 此法可用于各类食品中蛋白质含量测定，是国家标准方法（GB/T5009.5-1985）。
3、试剂 4、操作方法 取样：固体样品0.2-2g，半固态样2-5g，液体样品10-20ml。 消化剂：硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20ml。 消化结束：液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。 蒸馏：以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 以奈氏试剂〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕
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（二）脂蛋白的显色：
1、苏丹黑显色法： 将0.1g苏丹黑B溶解于煮沸的100ml60％的乙醇溶液中，制备成饱
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2
NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这 种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下， 其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计 来测其吸光度，确定含量。（560nm）
样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总
和。
二者之差可计算氨基酸含量
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应， 生成蓝紫色化合物，可比色定量。
二．个别氨基酸的定量测定
介绍了8种氨基酸的定量测定方法。
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
第七节 氨基酸的分离与测定
原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔1～2cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与 分解产物直接影响食品的色、香、味。
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折
射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和
碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。
具体测定方法：
凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根 据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液 吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这 种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下， 其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计 来测其吸光度，确定含量。（560nm）
样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总
和。
二者之差可计算氨基酸含量
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应， 生成蓝紫色化合物，可比色定量。
二．个别氨基酸的定量测定
介绍了8种氨基酸的定量测定方法。
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
第七节 氨基酸的分离与测定
原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔1～2cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。
蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与 分解产物直接影响食品的色、香、味。
蛋白质和氨基酸的测定优秀课件
蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折
射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和
碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。
具体测定方法：
凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根 据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液 吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
蛋白质和氨基酸的测定课件
蛋白质和氨基酸的测定
第一页，共68页。
（一）蛋白质组成与分类
1 . 组成Composition
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶 体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化 合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还有一 些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的 组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元 素组成百分比。
2H2SO4 +C＝CO2+2SO2+2H2O
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短 消化时间，常加入下列物质：
第十四页，共68页。
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分 解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾（1689 ℃ ）之后可以提 高至400℃以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断 的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点 升高，其反应式如下：
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
⑴ 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机 物脱水后被炭化为碳、氢、氮。
浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二 氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：
1.含量 由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀 的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组 织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高， 豆类含蛋白质最高。
第一页，共68页。
（一）蛋白质组成与分类
1 . 组成Composition
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它的溶液是典型的胶 体分散体系，由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化 合物，它主要组成元素是C 、H、O、N、S、P。另外还有一 些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。对于不同的蛋白质，它的 组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的蛋白质的元 素组成百分比。
2H2SO4 +C＝CO2+2SO2+2H2O
二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫， 氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。
在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短 消化时间，常加入下列物质：
第十四页，共68页。
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点而加快有机物分 解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾（1689 ℃ ）之后可以提 高至400℃以上。原因主要在于随着消化过程中硫酸不断 的被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点 升高，其反应式如下：
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定
⑴ 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 ＝ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机 物脱水后被炭化为碳、氢、氮。
浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二 氧化碳，硫酸被还原为二氧化硫：
1.含量 由于食品种类很多，所以蛋白质含量分布是不均匀 的，一般动物组织蛋白质含量高于植物组织，而且动物组 织以肌肉内脏含量较多于其他部分，植物是以种子含量高， 豆类含蛋白质最高。
食品中蛋白质和氨基酸的测定(食品分析课件)
4.6.4 双缩脲法测蛋白质含量
测定蛋白质的方法
物理性质 化学性质 染色性质 其他性质
紫外分光光 度法
凯氏定氮法
考马斯亮蓝 法
免疫比浊法
双缩脲法
银染法
Lowry法
双缩脲法——原理
1. 双缩脲的制备 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2
NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3
2. 双缩脲反应
蛋白质测定蒸馏过程装置
实验步骤——滴定
用少量水冲洗冷凝管下端 外部。取下接收瓶，以 0.01N盐酸标准溶液滴定 至淡紫红色为滴定终点。
实验结果处理
M
c (V1 V2 ) 1000 F 100%
m
式中： ω——蛋白质的质量分数；
c——HCl标准溶液的浓度； V1——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积； V2——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积； m——样品质量，g； M——氮的摩尔质量，14.01g／mol； F——氮换算为蛋白质的系数。
样品含氨基酸 态氮约为 0.4g/100mL
1份加入 3滴中性 红指示剂
用0.100mol/L NaOH标准溶液滴 定至由红变为琥珀 色为终点
另1份加 入3滴百里 酚酞指示剂 及中性甲醛 20ml,摇匀 静置反应 1min
用0.100mol ／L NaoH标 准溶液滴定至 淡蓝色为终点
中和游离酸
根据两者 耗碱液体 积之差可 求出氨基 酸含量
脲试剂4mL，室温下（20—25℃）放置30min，用 分光光度计测定吸光度。 3.结果计算
将测得的吸光度代入标准曲线的回归方程，求得 未知样品的蛋白质浓度。以mg/mL 计。
注意事项
1．本实验方法测定范围1－10mg/ml蛋白质。 2．各管由显色到比色的时间应尽可能一致。 3．有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应 混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取 上清液再测定。
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第二节 蛋白质的定性测定 （自学）
一、蛋白质的一般显色反应 电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合 并变色。书中列举了 5 种染料。 二、复合蛋白质的显色反应 （一）糖蛋白的显色（3种方法） （二）脂蛋白的显色（2种方法）
第三节 蛋白质的定量测定
测定总氮量→ N%×F =粗蛋白质含量%
因为：样品中除蛋白氮外，可能还包括有非蛋白 质含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物 碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。
⑤ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。
⑥ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易 产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始 消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入 少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注 意控制热源强度。
⑦ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续
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一、 凯氏定氮法
由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微 量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。
改良：氮的完全氨化，缩短时间，简化操作。 主要改良催化剂及消化蒸馏装置。
（一）常量凯氏定氮法
原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中 的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出。
<3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
凯氏定氮法注意事项
1、硫酸钾 及 硫酸铜的作用 2、火候控制 3、装置的气 密性 4、何时加碱 5、难消化的 对策 6、停止蒸馏
图：常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a．消化装置 b．蒸馏吸收装置
自动回流消化蒸馏仪
2. 蒸馏与吸收
消化液 + 40%氢氧化 钠加热蒸馏，放出氨 气。 “以奈氏试剂” 检查。
加热消化。
⑧ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于 含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组 氨酸、色氨酸、酪氨酸等时，需适当延长消化时间（如 大豆粉）。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色， 但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑨蒸馏装置不能漏气。蒸馏时，加热火力要稳定，否则 将发生倒吸现象。
2、蒸馏与吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4
2NH3↑+Na2SO4 + 2H2O
2NH3 + 4H3BO3
（NH4）2B4O7 + 5HБайду номын сангаасO
3、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl
2NH4Cl + 4H3BO3
(注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )
〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕 检验NH4+离子，析出黄色或红 棕色沉淀。
同时用4%硼酸吸收
3. 滴定
用HCl滴定 用混合指示剂（甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红）
终点：蓝色→微红色
计算：
蛋 白 质 （ % ） C （ V V 0 ） 0 .0 1 4 0 1 F 1 0 0 m
F要根据样品来源定
3学时
说明及注意：
①本法可应用于各类食品中蛋白质含量测定（粗 蛋白质）。结果准确，但费时。
②所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
③同时作一空白试验，从消化开始到滴定 。
④消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘 贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在 的情况下消化不完全而造成氮损失。
整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定
1. 消化
要防止暴沸
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
<2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、 汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。
① 用H3BO3吸收后再以标准HCl滴定或H2SO4溶液滴定。 根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。
② 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再 以标准NaOH滴定过量的酸。
为什么？
凯氏定氮法原理（方程式）
催化剂
1、消化：NCOC + 浓H2SO4 煮沸 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O
鸡肉 鸭 兔肉 牛肉 猪肉 带鱼 21.5 16.5 21.2 20.1 9.5 18.1 大豆 稻米 菠菜 苹果 黄瓜 牛乳 36.3 8.5 2.4 0.4 0.8 3.5
测定意义： ✓评价食品的营养价值。
✓为合理开发利用食物资源，提高产品质量， 优化食品配方及生产过程控制提供依据。
蛋白质的测定方法： 分两大类 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
蛋白质和氨基酸的 测定
第八章 蛋白质和氨基酸的测定
§8-1 概述 §8-2 蛋白质的定性测定（自学） §8-3 蛋白质的定量测定* （§8-4 蛋白质的末端测定） §8-5 氨基酸的定性测定（自学） §8-6 氨基酸的定量测定* §8-7 氨基酸的分离及测定
本章重点
1. 凯氏定氮法的原理及注意事项。 2. 蛋白质快速测定法有哪些？ 3. 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。
第一节 概述
O
H
||
|
蛋白质是复杂的含氮有机化合物。 C N
蛋白质换算系数F
玉米、鸡蛋、肉 6.25
花生 5.46
乳制品 6.38
大米 5.95
面粉 5.70
大豆及制品 5.71
蛋白质平均含N量（15-17.6）为16% 。
不同的食品中蛋白质含量不一样，一般动物性 食品的蛋白质含量高于植物性食品。
等测定蛋白质含量；
另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基（酸性和碱性
基团、芳香基团等）测定蛋白质含量。
其中： 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法等——多用于生 产单位质量控制分析。 国外：红外分析仪 在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定，通常采 用酸碱滴定法来完成。 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。