蛋白质和氨基酸的测定

<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，
纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高
至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
<2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧 化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化 钛。 <3> 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。 样品不用消化
2. 方法特点及应用范围
本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学 领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于 豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3.主要仪器： 分光光度计，离心机（4000 r/min） 4. 试剂： (1) 碱性硫酸铜溶液 (2) 四氯化碳
b.展开剂的选择方法： Ⅰ.微量圆环法。 Ⅱ.用小载波片试验，微量展开剂展开5cm。 Ⅲ.图解法： 样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。 样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 • 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、 苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、 正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。
北京福德泰和科技有限公司
产品名称： 凯氏定氮仪
二、双缩脲法
传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准 确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。 新开发的：双缩脲法、 紫外分光光度法、 染料结合法、 水杨酸比色法等。
1. 原理 脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至150~160℃时， 两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这 种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构 相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下， 其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计 来测其吸光度，确定含量。（560nm）
① 用 H3 BO3吸收后再以标准 HCl 溶液滴定。根 据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 ② 也可以用过量的标准 H 2 SO 4 或标准 HCl 溶液 吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。
整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定 1. 消化 总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应， 生成蓝紫色化合物，可比色定量。
二．个别氨基酸的定量测定
介绍了8种氨基酸的定量测定方法。
第七节
氨基酸的分离与测定
一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法） Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析 方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板 上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适 的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目 的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层 析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来 分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。
N = N×6.25 = 蛋白质含量 16%
一、 凯氏定氮法
由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、 微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。
（一）常量凯氏定氮法
1. 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋 白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸 出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫 酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。
2．特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其 发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品 中游离氨基酸的测定）
3．双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液， ③ 0.1%中性红50%乙醇溶液， ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。 4．操作：同时取两份样： ① + 中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。 ② + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。 二者之差可计算氨基酸含量
方法2、 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少 许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液， 弃去沉淀，储存于棕色瓶中。 • 结果计算： 注意：F——氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.25 也可查表。 • 说明： ① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ② 消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免 粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存 在的情况下消化不完全而造成氮损失。
⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试 样5 m1的比例增加硫酸用量。
⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如 含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等 时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全， 消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深 绿色。
• 操作方法： 以奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕 检验NH4+离子，遇铵根，离子析 出黄色或红棕色沉淀。 配制 方法1、 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升 水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶 液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。
蛋白质的测定方法分两大类： 一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折 射率等测定蛋白质含量； 另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和 碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。 具体测定方法：
凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法 国外： 红外分析仪
氨基酸总量——酸碱滴定法测定。
④ 展开：点样完了 ，放入密闭容器中 （展开 槽），倾斜一定角度10～30°，下端浸入展 开剂 1cm ，千万别让溶剂浸过了样点。到离 顶端一部分，取出样板、晾干、显色。
a. 展开剂的有关情况：主要是低沸点的 2 ～ 3 种有 机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展 开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的， 吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。
（一）原理：
取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层
板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各
组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等 作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不
同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目
的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，
鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以
面粉 9.9%，
苹果 1.4%
菠菜 2.4%，
黄瓜 1.0%，
测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的 营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质 量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控 制均具有极其重要的意义。
•一些蛋白质的含氮量 一般为 15%~ 17.6%，有的上下浮动 可以测出总氮 N
大致确定其含量。
• Rf = a / b
溶剂前沿 b 样点 a
点样原点
• 优点： ① 展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离 通常只需10 cm，且分离效果好。 ② 层析后得到的斑点小而清晰。 ③ 能够使用多种显色剂。 ④ 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100 倍） 精确到0.01ug。 ⑤ 也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备 层析。 • 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 • 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、 离子交换、凝胶等。
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三、 自动凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红 外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自 动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。
（三）操作方法： ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为 原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔1～2cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф 3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。
③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷 凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消 化完全。 ④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生 大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化 时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量 辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控 制热源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 m1 后再继续 加热消化。
仪器：要防止 爆沸。
2. 蒸馏
消化液 + 40% 氢氧化钠加热 蒸馏，放出氨 气。
3. 吸收与滴定 <1>用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指 示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。 指示剂 红色 吸收 绿色 滴定 红色
（酸） （碱） （酸）
<2> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再 用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红 指示剂。
⑧ 蒸馏装置不能漏气。
⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成 氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
氢氧化铜在70～90℃时发黑。
⑩ 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清 洗管口，再蒸1分钟后关掉热源
1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml 可用微量滴定管。 10 ml, 0.01 mol/L , 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L