食品中氨基酸和蛋白质的测定

（二）双缩脲法
方法特点及应用范围
灵敏度较低，但操作简单快速，故在 生物化学领域中测定蛋白质含量时常用 此法； 本法亦适用于豆类、油料、谷类等作 物种子及肉类等样品测定。
原理
在碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2) 能与Cu2+生成紫红色的络合物，这一反应称 为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与 Cu2+发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与 蛋白质含量在一定范围（1～10mg）内成正 比，可用分光光度计在波长540nm来测其吸 光度，确定含量。
2. 食品中的蛋白质含量
动物性食品：如牛肉中蛋白质含量为20.0%， 猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%， 牛乳为3.5%，黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%
植物性食品：大豆为40%，稻米 为8.5%，面 粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为 0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为 1.5%左右
（ 2）样品处理
含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取
含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄， 切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水， 捣成匀浆，称匀浆
液体样品直接吸取
置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭5g，加 热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤， 用30~40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于 100mL容量瓶中，定容，备用。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同 。 一般蛋白质平均含氮量为16%，即一 份氮素相 当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白 质系数。 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米 ，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46， 大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为 5.70，牛乳及其制品为6.38。
测定步骤
（1）样品处理 同甲醛滴定法
（2）样液测定
吸取含氨基酸的样品溶液5-10mL于100mL容量瓶中 ，加水至刻度，混匀后吸取20mL置于200mL烧杯中 ，加水60mL，插入酸度计的指示电极和参比电极， 开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至 酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升 数，供计算总酸含量。
试 剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液
（2）考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝
G250+乙醇+磷酸
测定步骤
（1）标准曲线的绘制
管号
1
100μg/mL牛血 0
清白蛋白标准溶
液的量（mL）
蒸馏水的量（ 1
mL）
蛋白质浓度（ 0
μg/mL）
2
3
4
5
6
0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1
0. 8 0. 6 0. 4 0. 2 0.0
氨基酸态 氮的测定
氨基酸总 量的测定
甲醛滴定法 电位滴定法
茚三酮比色法
氨基酸类 型和含量
的测定
氨基酸自动分析仪
（二）食品中氨基酸态氮的测定
1.甲醛滴定法
原理：氨基酸为两性电解质，既含有酸性的 羧基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水 溶液中，全部解离为双极离子形成内盐，当 加入甲醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱 性消失，游离出酸性的羧基，这样就可以用 标准碱溶液来滴定羧基，根据消耗的碱标准 溶液的体积即可计算出氨基酸态氮。
2.若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色 后再测定，或用电位滴定法进行测定。
2.电位滴定法
原理：氨基酸为两性电解质，既含有羧 基又含有氨基，加入甲醛后，甲醛与氨 基酸的氨基作用，使羧基显示出酸性， 用氢氧化钠标准溶液进行滴定，以酸度 计测定终点pH=9.2 。
仪器
❖酸度计
酸度计
磁力搅拌器
试剂
（1）40％中性甲醛溶液 （2）0.05mol/L NaOH标准溶液
成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成 匀浆，称匀浆 液体样品：直接吸取 将样品置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭 5g，加热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌， 过滤，用40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液 备用。
（2）测定
在上述滤液中加入3-4滴酚酞指示剂，用 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅 红色，而后加入中性甲醛20mL，摇匀，浅红 色消失（为什么？）。继续用0.1mol/L氢氧 化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，记录自 甲醛加入后所消耗的0.1mol/L氢氧化钠标准 溶液的体积。
食品中氨基酸和蛋白质的测 定
第十章 食品中氨基酸和 蛋白质的测定
一、氨基酸的测定 二、蛋白质的测定
一、氨基酸的测定
（一）概述
➢ 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的 最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸 20种。
➢其中必需氨基酸8种:亮氨酸、异亮氨酸、 赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色 氨酸和缬氨酸。
向上述溶液中加入10mL 40%中性甲醛溶液，混匀。 再用氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录自加 入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。
（3）做空白实验
结果计算
式中：C---氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L） V---样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL） V0---空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL） m---样品的质量（g） 0.014 ------氮的毫摩尔质量（g/mmol）
（4）做空白实验
结果计算
式中：C---待测ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ液的氨基酸含量（µg） m---样品的质量（g） v1---样品溶液总体积（mL） v2---测定用样品溶液的体积（mL）
说明
该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非 常灵敏，测定蛋白质浓度范围为0～ 1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速 测定方法。
放置0.5-1h，以充分提取，而后离心20min， 上清液转入10mL容量瓶中，定容。
（3）测定
吸取提取液0.1mL，分别放入10mL具塞 试管中，加蒸馏水0.9mL，加入5mL考马 斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置2min，于 595 nm下比色，测定吸光度，根据吸光度 从标准曲线上查得待测液中蛋白质含量。
甲醛反
应R CH COO－HCHO R CH COO－
NH3+
NHCH2OH
H+
羟甲基氨基酸
HCHO R CH COO－ N(CH2OH)2
二羟甲基氨基酸
试剂
（1）40%中性甲醛 （2）1%酚酞指示剂 （3）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液 （4）活性碳
仪器
测定步骤
（1）样品处理：
对于含水量少的固体样品粉碎过筛，混匀，称样 含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切
3.蛋白质测定方法
测定蛋白质的方法可分为两大类： ➢一类是利用蛋白质的共性，即含氮量 、肽键
和折射率测定蛋白质含量 ； ➢另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸
性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含 量。
具体测定方法
凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。 快速测定法：双缩脲反应、Folin-酚法、考马斯
（3）测定
吸取样液1~4mL于刻度试管中，按照标 准曲线测定
结果计算
式中：C---待测溶液的氨基酸含量（µg） m---样品的质量（g） v1---样品溶液总体积（mL） v2---测定用样品溶液的体积（mL）
说明与注意事项
1.茚三酮受光、空气、温度、湿度等影响而被氧化 成淡红色或深红色，使用前必须纯化。
操作步骤
（1）样品处理
水解：准确称取固体样品50~200mg，小 心加入水解管中，加入6mol/L HCl 10mL , 酒精喷灯封管后，置烘箱中于110℃水解2224小时。
封管的三种方式：
液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将 水解管直接置液氮中，否则容易冻裂） 真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵 抽力太大，则容易在封管过程中将软化的玻 璃抽碎） 氮吹仪吹氮气15分钟后封管。
水合茚三酮 还原 茚三酮
蓝紫色物质
试剂
（1）2% 茚三酮溶液: 茚三酮+SnCl2 （2）pH 8.04磷酸缓冲液 （3）氨基酸标准溶液:亮氨酸
❖测定步骤
❖（1）绘制标准曲 试❖1管.管制号作线甘露糖0标准曲1 线：2 3 4
氨基酸标准液 0
（200µg/mL）
氨基酸含量（ 0
µg）
加蒸馏水
8
（2）样品分析
自动分析仪氨基酸分离图谱
测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面 积计算出氨基酸的精确含量。根据峰出现 的时间可以确定氨基酸的种类。
二、蛋白质的测定
（一）概述
1.蛋白质的生理功用及在食品中的作用
（1）蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组 织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切 有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。 （2）人体的酸碱平衡、水平衡的维持； （3）遗传信息的传递； （4）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。 （5）人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物， 来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质； （6）衡量食品的重要营养指标。
亮蓝G250法、紫外吸收法
（一）考马斯亮蓝法
原 理考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当其与蛋
白质结合后变为青色，在一定范围内（01000μg/mL），颜色的深浅与蛋白质含量成正 比，在波长595nm下比色，测定吸光度。
此反应十分迅速，在1h内保持稳定，反应非 常灵敏。
❖仪 器
电子天平
❖紫外-可见 分光光度计
❖测定步骤 （1）标准曲线的绘制
样品过滤和定容：水解后的样品取出冷却至室温， 开管后过滤到25mL容量瓶中，水解管用去离子水洗 涤3次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤 纸，洗涤液也收集到容量瓶中。定容。 脱酸：吸取样液 1-2mL，置真空脱酸仪上脱酸。温 度 60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止
。
脱酸后的样品，加入 1-2mL 蒸馏水溶 解，置振荡混合器上混合均匀，针管吸 取少量，通过0.45或0.22µm过滤器过滤 后，上机分析。
2.茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在1h保持稳 定，故应抓紧时间比色。
3.该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水。
无氨蒸馏水制备
方法：普通蒸馏水中加硫酸调至pH<2，使水中各种 形态的氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓冲 球的蒸馏器进行蒸馏，收集馏出液即可。
（三）氨基酸自动分析仪法
原理
利用各种氨基酸的不同性质，使用阳离子 交换树脂在色谱柱上进行分离。洗脱下来的 氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜 色深浅与氨基酸的含量成正比。
O
O O
2H2N－C
－NH2
1320 C
H2N－C－N－C－NH2＋
NH3↑ H
尿
双缩脲
素
双缩脲 CuSO4+NaOH 紫红色物
质
❖仪 器
电子天平
❖紫外-可见 分光光度计
❖试 剂
（1）双缩脲试剂 :硫酸铜+酒石酸钾钠
+NaOH
（2）0.05mol/L的NaOH溶液
（3） 5mg/mL标准酪蛋白溶液
说明及注意事项
1.此法适用于测定各类食品中的游离氨基 酸。 2.操作简便，结果准确性高。
（二） 氨基酸总量的测定
原理
------茚三酮比色法
氨基酸在碱性溶液中与水合茚三酮作用，生 成蓝紫色化合物，其颜色深浅在一定范围内 与氨基酸含量成正比，在波长570nm下比色 ，测定吸光度。
脯氨酸与水合茚三酮作用生成黄色化合物， 需在波长440nm下比色。
（3）做空白实验
结果计算
式中：C---氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L） V---样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL） V0---空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL） m---样品的质量（g） 0.014 ------氮的毫摩尔质量（g/mmol）
说明及注意事项
1.该方法简便、易行，适用于测定食品中 的游离氨基酸态氮。
20
40
60
80
100
分别向各试管中，加入5mL考马斯亮蓝，盖塞， 充分混合，放置2min，于595 nm下比色，测定吸 光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标 ，绘制标准曲线。
（2）样品处理
含水量少的固体样品粉碎，称取0.10000.2000g于离心管中，加蒸馏水10mL；
含水量多的固体样品加等量的水捣成匀 浆，称取匀浆2-5g于离心管中，加蒸馏 水6mL；
（mL） pH 8.04磷酸缓 2 冲液（mL） 2% 茚三酮溶 2 液（mL）
1 2 34 200 400 600 800 7 6 54 2 2 22 2 2 22
56 56 1000 1200 32 22 22
混匀，置于沸水浴中加热15min，冷却后 ，用水定容至50mL，静置15min后，在 波长570nm下比色，测定吸光度。以氨 基酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标 ，绘制标准曲线。