第9章 蛋白质和氨基酸的测定

三、燃烧法（杜马斯法）
1.原理
试样在900℃～1200℃高温下燃烧，燃烧过程中产生混合 气体，其中的碳、硫等干扰气体和盐类被吸收管吸收，氮 氧化物被全部还原成氮气，形成的氮气气流通过热导检测 仪（TCD）进行检测。
2.应用
欧美等发达国家,杜马斯法已经成为法定的氮/蛋白质分析 方法。在美国、加拿大和德国的某些领域,杜马斯法甚至 作为唯一的定氮标准。 杜马斯法目前已被很多组织认可，如AOAC,ASBC,EBC,AACC 和ISO。
9.2


蛋白质的测定
显色反应

定性分析
氨基黑法 溴酚蓝法 考马斯亮蓝法 酸性品红法 氨基萘酚磺酸法 过碘酸-Schiff 氏试剂显色法 甲苯胺蓝法 阿尔新蓝法 适用脂蛋白 苏丹黑法 油红-O法
适用糖蛋白

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蛋白质的定量测定
一些蛋白质的含氮量一般为 15%~ 17.6%
-aa structure
Cn name
En name threonine cystine tyrosine asparagine
NH2 CH3SCH2CH2 CHCOOH CH2 NH CH2 CH2 CHCOOH NH2 CH2 CHCOOH
NH2 CH2 CHCOOH
N
HO NH2 CH3CH CHCOOH NH2 HS CH2 CHCOOH
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⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢 氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 氢氧化铜在70～90℃时发黑。 ⑩硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的 吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中 使用。 ⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸 收液倒吸。
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蛋白质中N的转换因子
食品 蛋或肉 乳制品 小麦 其他谷物及油料种子 杏仁 坚果 其他种子和椰子 转换因子 6.25 6.38 5.70 6.25 5.18 5.46 5.30
蛋白质的主要特性
1. 作为氨基酸的聚合物，蛋白质有酸性和碱性两种性 质， 两性离子 & 等电点& 电泳 2. 大多数蛋白质是水溶性的，不能透过透析膜 3. 变性：加热，酸，碱，盐和洗涤剂都会使蛋白质的 溶解性和功能特性改变 可逆的/ 不可逆的变性 4.在280nm的紫外吸收，因存在三种带有芳香基团的氨 基酸残基：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸
NH2 H2NCH2CH2CH2CH2 CHCOOH
NH2 NH H2N C NH CH2CH2CH2 CHCOOH
赖氨酸* 精氨酸 组氨酸
=
N N H
NH2 CH2 CHCOOH
basic
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化学特性

氨基酸是两性电解质
RCHC O2H
NaOH
有两性 -COOH, -NH2
NH2
+
HCL
R NH2 CH COO
蛋白质的测定方法分两大类
一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品 牛肉 20.0% 鸡肉 20% 大豆 40% 黄瓜 1.0% 猪肉 9.5% 牛乳 3.5% 面粉 9.9% 苹果 1.4% 兔肉 21% 带鱼 18.0% 菠菜 2.4%
一、是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键 或折射率等测定蛋白质含量； 二、是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性 和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白 质含量。
一、凯氏定氮法
由Kieldhl于1833年提出，现发展为常 量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改 良凯氏法。
N = N×6.25 = 蛋白质含量 16%
（一）常量凯氏定氮法
原理:
1.消化： 样品和浓硫酸与催化剂一同加热消化，样品中的有机 氮转化为氨与硫酸结合生成硫酸铵。
催化剂
3. 用硼酸吸收 : 用硼酸溶液吸收NH3 ，生成硼酸铵 2NH3 + 4H3BO3
H OH
RCHC O2N+H3
H OH
+
R + NH3 CH COOH
阴离子，在高 pH时
在等电点时是偶极离子
阳离子，在低 pH时
注意: 氨基酸和蛋白质都有酸性和碱性特性，它们都是在低pH 值时带正电荷，在高pH值时带负电荷
氨基酸的等电点(pI)
阳极 + + + + + + + + + 阴极
2. 蛋白质概况
2. 中和&蒸馏：加碱蒸馏，使氨蒸出
2NaOH +（NH4）2SO4
→ 2NH3↑+Na2SO4 + 2H2O
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凯氏定氮法的装置
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯 硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高至 400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高 沸点，但效果不如硫酸钾。 <2> 加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终 点指示剂，以及蒸馏时碱性指示剂。还可以加 氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧 化钛。 <3> 加氧化剂 物氧化速度。 如双氧水、次氯酸钾等加速有机
④ 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生 大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时 应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛 醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热 源强度。 ⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷 却，加入30％过氧化氢 2～3 m1 后再继续加热消 化。
⑥ 若取样量较大，如干试样超过5 g， 可按每克 试样5 m1的比例增加硫酸用量。 ⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可， 但对于含有特别难以氨化的氮化合物的品。如 含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸 等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完 全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时， 呈较深绿色。 ⑧ 蒸馏装置不能漏气。
样品+浓硫酸 +催化剂 CuSO4
消化+40% 氢氧化钠 加热蒸馏， 放出氨气。
I. 消化设备
II. 蒸馏和吸收设备
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<4>用4%硼酸吸收，用盐酸或硫酸标准溶液滴 定，指示剂用混合指示剂：甲基红+亚甲基 蓝（2:1）；甲基红—溴甲基酚绿（1:5）

2 份甲基红乙醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶 液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH 5.4； 1 份甲基红乙醇溶液与5 份溴甲酚绿乙醇溶 液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1。 同时作试剂空白。
NH2 HOOC CH2 CHCOOH
Cn name 天门冬氨酸
acidic
En name Aspartic acid Glutamic acid lysine arginine histidine
物理特性

NH2 HOOC CH2CH2 CHCOOH
谷氨酸
所有纯净的 -AA 是无色晶体 , 有很高的熔点 (200~300 ℃) 有旋光度，除了甘氨酸 不溶于石油和苯等，但溶于水

<5> 用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收， 再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用 甲基红指示剂。

结果计算
蛋白质含量= C×（V1-V2）×M m×1000
注意： F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为 6.25 ；纯乳 与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生 为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋 白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸 麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
→ （NH4）2B4O7 + 5H2O
4.用强酸滴定 : 盐酸溶液 (NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl → 2NH4Cl + 4H3BO3 5. 计算 ：（N: HCl = 1:1)
2NH2（CH2）2COOH + 13H2SO4
加热
（NH4）2SO4 + 6CO2 +
12SO2 + 16H2O一定要用浓硫酸（98%）
测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价 值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配 方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。
具体测定方法
蛋白质 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍，此外 还有双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法，国 外：红外分析仪。 氨基酸 氨基酸总量——酸碱滴定法测定。 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。
NH2 CH2COOH NH2 CH3 CHCOOH
CH3 NH2 CH3 CH CHCOOH
CH3 NH2 CH3 CH CH2 CHCOOH
CH3 NH2 CH3 CH2 CH CHCOOH
-aa structure
Cn name 蛋氨酸* 脯氨酸 苯丙氨酸*
En name methionine proline phenylalanine
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主要内容 第9章 蛋白质和氨基酸的测定
1. 概述

蛋白质和氨基酸概况 定性测定 定量测定 定性测定 定量测定
2. 蛋白质的测定

3. 氨基酸的测定

9.1 概述
1.氨基酸概况
氨基酸(AA) : 氨化了的羧酸(R-COOH)
蛋白质中常见的20种 -AA
-aa structure Cn name 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸* 亮氨酸* 异亮氨酸* En name glycine alanine valine leucine isoleucine

RCHC O2H NH2
HOH+
RCHC O2NH2
在碱性溶液中 阴离子
RCHC O2N+H3
RCHC O2H N+H3
达到等电点时是两性 离子，不会移向任何 一个电极，且溶解性 最低
在酸性溶液中 阳离子
-

pH溶液>pI
pH溶液<pI
20种 - 氨基酸的聚合物, 分子量从5000到 1000,000 道尔顿 细胞中最丰富的组分：占细胞干重的50%。 N是最显著的元素：组成元素包括 C,H, N, O, S, 对于某些蛋白质：P, Cu, Fe, I。 不同蛋白质中的N含量在13.4% -19.1%, 平均为 16%，所以对于大多数蛋白质来说蛋白质系数是 6.25。 在食品和生物材料中除蛋白质外，可能还包括有 非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化 合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。
说明及注意事项
①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ×F×100(g/100g) ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附 在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情 况下消化不完全而造成氮损失。 ③消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。
全自动凯氏定氮仪（吸收、蒸馏、滴定）
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二、分光光度法
原理：食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解， 分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，在pH 4.8 的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应 生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡 啶化合物。在波长400 nm 下测定吸光度值，与 标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋 白质含量。
3.方法的优势与劣势

四、双缩脲法
1.原理：脲（尿素）NH2—CO—NH2 加热至
150~160℃时，两分子缩和成双缩脲。 NH2—CO—NH2 + NH2—CO—NH2 NH2—CO—NH—CO—NH2 + NH3
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双 缩脲反应。（缩二脲反应） 蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— 与双缩脲结构相似。在 同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白 质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。 （540nm） 注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化。
苏氨酸* 半胱氨酸
HO
NH2 CH2 CHCOOH
酪氨酸 天门冬酰胺
色氨酸* 丝氨酸
tryptophan
NH2 NH2 COCH 2 CHCOOH
NH2 H2NCOCH 2CH2 CHCOOH
H
NH2 HO CH2 CHCOOH
serine
谷酰胺
glutamine
1
2Baidu Nhomakorabea16-12-13
-aa structure
（二）微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点： 加入硼酸量有50 ml → 10 ml 滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L → 0.01mol/L 可用微量滴定管。 3、蒸馏装置
微量凯氏定氮法装置 （三）自动凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、特点
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外 线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消 化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动 数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12 分钟完成1个样。