【重庆医科大学】细胞生物学---第十一章-细胞工程

Fluorescence microscopy image of FITC-peroxides loaded polypeptide microcapsules
（三）抑制细胞凋亡
培养的后期，维持细胞的高活力是关键
细胞凋亡是大规模培养时细胞死亡的主要原因 细胞静止（cell rest）技术可以有效降低营养 成分消耗和代谢毒物产生，对提高培养细胞表 达目的蛋白的产率是一种有效的手段
与产品纯化的关 系
下游产品纯化容易，产品回收率高，不 存在病原体污染问题，易于产业化
实用性
适用细胞谱系较宽
适用细胞谱系窄。对某于具体的某种细 胞的培养，通常摸索其培养条件。由于 培养基的黏度小，其细胞在培养过程中 易受机械损伤
二、大规模细胞培养系统
（一）悬浮培养系统
（二）气流驱动培养系统 （三）微载体培养系统 （四）灌注培养系统
2.显微注射法
受精卵显微注射技术是制备转基因动物最常用的方法，其基本操作程序 是：将目的基因经过适当的限制性内切酶酶切、纯化并溶解在注射缓冲液 中备用。显微注射时先从供体动物的输卵管内取出受精卵，利用倒臵显微 镜和显微操作系统将所要研究的基因注射入受精卵的雄原核，再将此受精 卵植入受体动物的输卵管中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
GCS technology enables life science researchers to mimic in vivo morphology in an in vitro environment
Glass Ball Spinner Systeme
2. 中空纤维（hollow fiber ）
显微操作系统
显微注射
3. DNA直接注射法
DNA直接注射法主要用于开发核酸疫苗和基因治疗。核酸疫苗也叫基因 疫苗（genetic vaccine）、核酸免疫（nucleic acid immunization）、 DNA免疫（DNA based immunization），是指将含有编码抗源蛋白的基
LTR φ IL-2 标记基因 LTR
重组逆转录病毒 (核酸部分只能是重组逆转 录病毒载体)
4
1
3
2
LTR gag pol env LTR
胞，表达检测

导入方法很多，大致可分
为：物理法、化学法和生
物学方法
二、基因转染载体

病毒载体
逆转录病毒载体
腺病毒载体 腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体 EB病毒载体 杆状病毒 慢病毒 嵌合 (杂合 )病毒载体
• 非病毒载体
磷酸钙转染法 DEAE-葡聚糖转染法 脂质体介导 多聚阳离子聚合物 电击法 显微注射法 基因枪 超声波辅助转染
• 可使细胞始终处于一个较好的营养状态和生存环境
• 可以在 “旧”培养基中连续收集培养细胞所分泌的某些产
物 • 可以根据特殊的要求，通过改变培养液的组成实现对于细 胞状态的人为调控
三、大规模培养中优化细胞生长的环节
（一）量化评估大规模培养细胞的营养需求 （二）探索大规模培养细胞合适的生存环境 （三）鉴定细胞的健康状况
在本培养体系中生长，如用于制备单克隆抗体的杂
交瘤细胞 • 不需要发动机和搅拌装臵
（三）微载体培养系统（microcarrier culture system）
• 微载体与搅拌悬浮培养相结合的一种培养体系 • 适于贴壁生长细胞的大规模培养 • 微载体培养技术复杂
（四）灌注培养系统（perfusion culture system）
大规模细胞培养（large-scale cell
culture）技术：是在人工条件下（设
定ph、温度、溶氧等）高密度大规模的
在生物反应器（bioreactor）中培养细
胞用于生产生物产品的技术。它是细胞
工程的重要组成部分，已成为生物制药
领域最重要的关键技术之一。
一、大规模细胞培养的基本原则
（一）增加培养容积
细菌载体 噬菌体载体

三、基因转染方法和原理
（一）化学法介导的基因转染
1.脂质体介导的转染
DNA通过脂类包被而被转染，这些脂类或者直接与细胞
膜相互作用——膜融合；或者通过非受体介导的内吞作用进
入细胞，推测这可能是在内吞小体内进行膜融合。
转 染 复 合 物 形 成 过 程 示 意 图
膜融合
脂质体
脂 质 体 转 染 流 程 图
2.磷酸钙转染法
基本原理：HEPES/BES缓冲盐水与含有CaCl2及DNA的溶液缓慢混合
可形成含磷酸钙和DNA的沉淀。细胞经内吞作用将磷酸钙/DNA沉淀吸收。
提高磷酸钙转染效率方法
① 氯喹处理细胞：氯喹为弱碱性，抑制细胞内溶酶体对DNA的降解作
用。1:1000加入100 mmol/L的氯喹加入到培养基中 ② 丁酸钠处理细胞：机制不明,但它是组蛋白脱乙酰基抑制剂,推测丁酸 钠会导致组蛋白过乙酰化形成是外来质粒DNA趋于转录的染色质结 构。将500mM丁酸钠直接加入转染后的细胞培养基中
第二节 细胞核移植
nuclear transfer
核移植与动物 克隆过程
核移植：取核（A/B）---移入新核（C/D）
人类治疗性克隆 human therapeutic cloning
第三节 基因转移技术
一、基因转染原理

将目的基因导入靶细胞,
使之表达

涉及到基因，基因表达元
件， 导入方法， 导入细
半透膜性两端开口的中空纤维，直径约200μm
细胞附着于外表面，内部有培养液通过
利于分泌型表达蛋白的纯化，不易放大培养
Cross-section through hollow fiber culture system showing extracapillary space
Hollow Fiber Cell Culture Systeme
因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入体内，通过宿主
细胞表达抗原蛋白，并由其诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以 达到预防和治疗疾病的目的。
（二）生物法介导的基因转染
举例：逆转录病毒载体转染法
1. 逆转录病毒的结构 长末端 重复序列 包装信号 LTR 调节和 启动转录 φ gag pol env LTR
第十一 章 细胞工程 （Cell Engineering）
陈俊霞
现代生物工程（Modern Bioengineering ）
• 基因工程 • 酶工程
• 发酵工程
• 蛋白质工程 微生物细胞工程 •细胞工程‫٭‬ 植物细胞工程
动物细胞工程
细胞工程（cell engineering）
应用细胞生物学发育生物学、遗
DEAE-葡聚糖在培养液 中的终浓度(ug/ml) 400 200 100 50 80 40 20 10 DNA/TBS (ul) 10mg/ml DEAE-葡聚糖 (ul) 160 80 40 20 240 120 60 30 总体积 (ul)
（二）物理法介导的基因转染
1.电穿孔转染法
电穿孔的攻击引起膜凹陷然后瞬时形 成直径波动在2nm至数纳米之间的疏水 小孔。 某些较大的疏水孔转变成亲水性的小 孔。分子穿过亲水性小孔的详细机制未 知，可能包括电泳、电内渗透、扩散与 内吞作用。当小孔开放时，最多可有 0.5pg的DNA进入细胞。150kb的DNA可 轻易通过小孔，可见DNA分子的大小并 不妨碍其进入细胞，DNA不接触内吞小 体与溶酶体的酸性环境而直接进入胞质。
2. 微胶囊（microcapsule）
半透性膜所围成的囊，直径200μm左右 细胞生长在囊的内壁
细胞密度大(108/ml), 产物浓Hale Waihona Puke Baidu高, 分离纯化相对简单
需研究人员自行制备
A scanning electron microscope image of a fractured microcapsule, once filled with healing agent
传学和分子生物学等学科的理论与方 法，在细胞水平上，按照人们的需要
和设计对细胞的遗传性状进行人为地
修饰，以获得具有产业化价值或其它
利用价值的细胞或细胞相关产品的综
合技术体系,也称细胞技术。
细胞工程所涉及的技术方法
基因操作 细胞的遗传修饰
细胞融合
细胞器移植 细胞的表型分析
细胞重组
细胞和组织培养 克隆技术
（一）悬浮培养系统（suspension culture system）
• 细胞产量是最高的
• 仅适合于悬浮生长细胞
旋转细胞培养系统（Rotary Cell Culture System , RCCS）
（二）气流驱动培养系统（airlift culture system）
• 被成功培养的细胞有：HeLa、BHK21、人类原始 淋巴细胞以及植物细胞等 • 凡适合于在搅拌悬浮培养体系中生长的细胞都可以
出的RNA，只含有病毒基因组的部分序列及标记基因和目的基因 的转录产物，同时还具有包装信号。这种病毒颗粒只具有一次感染 性，感染其它细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒 （pseudoviral particles）。假病毒颗粒可分泌到包装细胞的培养上 清中，具有对靶细胞的感染能力。
逆转录病毒载体
染色体工程
干细胞工程
胚胎工程
组织工程
工程化细胞的应用 ……
第一节
大规模细胞培养
Large-scale Cell Culture
细胞培养(cell culture)：在无菌条件下，
从机体中取出组织或细胞，模拟机体内正常 生理状态下生存的基本条件，让它在培养器
皿中继续生存、生长和繁殖的方法。可分为
原代细胞培养和传代细胞培养。
产生病毒 产生 产生病毒 核心蛋白 逆转录酶 外膜蛋白
2. 逆转录病毒载体的构建
将病毒前DNA经适当改造并插入质粒后构建而成
常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体
长末端 重复序列 包装信号
LTR 调节和 启动转录 φ gag env 目的基因pol 标记基因 LTR
3.
包装细胞(packaging cell)
• 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）
导入哺乳动物细胞而制备成的一种特殊细胞系。这种细胞因携带有
逆转录病毒基因组而能大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒缺乏包 装信号（ψ序列）而不能包装
• 逆转录病毒载体导入包装细胞后，插入基因组。由逆转录病毒转录
（二）增大细胞的附着面积 （三）抑制细胞凋亡 （四）无血清培养
（一）增加培养容积
首要考虑因素
培养的容积越大，细胞的产量就越高
是提高悬浮生长细胞产量的最重要因素
（二）增大细胞的附着面积
提高细胞产量的另一个重要因素
培养容器中添加细胞附着生长的支持物
常用的支持物主要有：
微载体（microcarrier）
③ 甘油处理细胞
3. DEAE-葡聚糖转染法
基本原理： DEAE-葡聚糖是一种高分子量的正电荷多聚体， DEAE-
葡聚糖的作用机制并不甚明了，推测由于高分子量正电荷多聚体可以作
为桥梁连接带负电荷的核酸与带负电荷的细胞外膜。 DEAE-葡聚糖 /DNA复合体通过内吞作用进入细胞后，DNA通过某种未知机制脱离酸度 越来越大的内吞小体，穿过核膜进入核内。 DEAE-葡聚糖最适浓度测定
获取组织 获取细胞 细胞生长 细胞传代
原代培养
传代培养
原代培养 传代培养
细胞系(cell line)：原代细胞经首次传代成功后 的细胞。分为有限细胞系和连续细胞系
细胞株(cell strain)：从一个生物学鉴定的细胞 系中用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单 细胞增殖形成具有特殊性或标志的细胞群。
（四）无血清培养
血清培养基与无血清培养基的比较
血清培养基 质量稳定性 存在批次的差异 无血清培养基 有明确的质量标准，避免了批次差异
培养基成份
影响细胞生长的因子多、复杂程度高、 成分明确，培养基可针对不同的细胞株 不明确因素多 进行成分优化，以达到最佳培养效果 血清中蛋白含量 > 45g/l，成分复杂， 且易被病毒或支原体污染，不利于下 游纯化工作，产业化成本高
中空纤维（hollow fiber）
微胶囊（microcapsule）
1. 微载体（microcarrier）
高分子微细实心颗粒，100～300μm
集单层培养和悬浮培养的特点于一体
增大细胞附着面积十分明显
Cells on microcarrier
HEK 292 cells on microcarriers infected with Adenovirus with GFP marker