ITC等温量热滴定数据疑难解答
ITC等温滴定量热法的操作说明解读
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
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独特特点：
– 它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即 具有非特异性的独特优势，
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
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INS
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典型的ITC数据
等温滴定量热法讲解
– 尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异 性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规 律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
– ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术能提 供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固定。ITC 的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
可获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常 数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（△H）、摩尔 结合熵（△S）、摩尔恒压热容（△Cp），和动力学参数(如 酶促反应的Km和kcat）,用来表征生物分子间的相互作用。
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独特特点：
– 样品用量小，方法灵敏度和精确度高(仪器最小可检测热功率2 nW，最小可 检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ - 80 ℃，滴 定池体积(1.43 ml)。
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history
built in the secondhalf of the 1960s to study chemical reactions.
During the1970s, the sensitivity of instruments was in the range of mJ, and other first applications were developed such as the study of (metal + ligand) complexes [8] and the adsorption of aromatic compounds by molecular sieves .
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ITC(等温量热滴定法)
Q = f (t)
GE Healthcare 公开技术质料
ITC分析仪
ITC重要概念
与TP（左）：
KD = 120 nM, 但∆H异常（高出103倍） n = 0.01 过低
因此研究Y与BSA作对比 与BSA（右）： KD，∆H，n 均同Y与TP 的接近
与TP
与牛血清白蛋白BSA
Æ Y与TP无特异性结合，不适于进一步研究
GE Healthcare 公开技术质料
PL shrinkage NP-PL binding
∆H影响曲线与y-轴的截距
n影响积分曲线的拐点
K与结合位点总浓度n [Mt]影响积分曲线的整体形状
GE Healthcare 公开技术质料
ITC曲线分析：反应的结合推动力
吉布斯自由能（∆G）与结合常数（KD）相同、 但结合机理不同的两个结合反应 等温：∆G = ∆H -T ∆S
∆G < 0主要由-T ∆S贡献，该 反应为熵增推动的结合反应
GE Healthcare 公开技术质料
原始数据
ITC实验
积分结果
• 原始数据： 显示随着滴定进行，补偿加热丝补偿给样品池和参比池的热量速率差
• 积分结果： 将每次滴加所产生的热流差对时间进行积分，并以在对应时间点样品 池内反应物反应物的摩尔比为横轴 实线为最佳拟合曲线
ITC分析法能提供哪些信息？
ITC曲线积分结果 GE Healthcare 公开技术质料
反应导致熵减小（ -T ∆S > 0）， 但∆H减小很多，使∆G < 0反应
ITC等温滴定量热法的操作说明
实验总结
实验结果的讨论及其意 义
分析实验结果，讨论相互作 用的特性、结合亲和力等， 并探讨结果对相关研究领域 的意义。
需要改进的方面
总结实验中的不足和问题， 提出改善和优化实验方法的 建议。
ITC 等温滴定量热法的 重要性
介绍ITC等温滴定量热法在生 物研究中的应用和优势，强 调其对解决科学问题的重要 性。
确保样品和配体的纯度和浓度，准备适 当的缓冲液进行滴定实验。
结果分析
信息的含义
通过分析数据，可以获得化学反 应的热效应、平衡常数、热力学 参数等信息。
数据的解释
异常情况处理
根据实验条件和数据分析结果， 解释实验中观察到的现象和趋势， 揭示背后的机理。
记录并分析实验中可能出现的异 常情况，如峰形变异、噪音等， 以确定实验结果的可靠性。
实验步骤
1
实验参数调整
2
根据实验需求，调整参数如温度、浓度、 滴定量等，以优化实验结果。
3
实验过程数据处理
4
将实验中得到的热效应数据转化为相关 参数，并进行数据分析和解释。
操作流程
按照以下步骤进行实验： 1. 样品和配体的准备 2. 初始化仪器 3. 进行等温滴定实验 4. 结束实验并保存数据
样品处理和置换缓冲液
ITC等温滴定量热法的操作说明
I. 简介 A. ITC (等温滴定量热法) 是一种测量在生物分子之间发生的相互作用的热效应的技术。 B. ITC 在生物科学研究中广泛应用，例如研究蛋白质结合、药物相互作用等。 . ITC 的优势包括无需标记物质、直接可测量热效应以及定量分析结果。 II. 实验前准备 A. 准备所需的仪器和试剂，包括等温滴定量热仪、样品和配体等。 B. 检查和准备实验所需设备，如清洗实验容器、校准测温系统等。 C. 遵守实验室的安全操作规程，戴上个人防护装备。
ITC培训第二课
查看猜想值 的拟合
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弱结合 – 固定 N-’低 C’
勾掉 vary 以固定N
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竞争性实验
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竞争性实验
• 扩展ITC实验的亲和力范围
– Submillimolar (10-2) 到 picomolar (10-12)
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拟合数据
3. 查看 Chi^2
2. 反复多次以 提高拟合 1. 拟合到 ‘one set of sites’ 模型
20数据
N = 0.86 KD = 1/KA = 16 nM ΔH = -14.66 kcals/mol
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MicroCal™ ITC 系统 培训课程
数据分析
目标
• 演示如何检查数据 • 演示如何扣减参照热 • 演示如何用1:1结合模型拟合数据 • 演示如何用复杂的结合模型拟合数据和竞争实验数据拟合 • 理解从 ITC 数据中如何测定 ΔG, ΔH 和 TΔS
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数据分析
额外的参考实验和实验优化
• 参照热小，因此绝对准确的测量有难度 • 不能苛求对照实验中的稀释热和滴定实验中的完全吻合
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‘one set of sites’模型
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记录数字并重新拟合 …用于不完美的对照和 实验优化
Chi^2
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K1: one set of sites
-10 0 0
Time (min)
等温滴定量热法浓度优化
等温滴定量热法浓度优化等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种广泛应用于生物化学、药物研发和生物医学领域的实验技术。
通过测量反应在等温条件下产生或吸收的热量，ITC可以帮助研究人员了解溶液中分子之间的相互作用，如配体和受体的结合、酶催化反应以及protein-protein 相互作用。
通过优化等温滴定量热法的浓度参数，可以提高实验结果的质量和可靠性。
在优化等温滴定量热法的浓度时，有几个关键因素需要考虑。
首先是实验物质的浓度范围。
选择适当的浓度范围可以确保反应产生的热量在仪器检测范围内，同时减少背景噪音的干扰。
一般来说，对于正常的反应热量，推荐使用0.1-2.0 mM的溶液浓度。
然而，对于特殊的反应系统，需要事先进行一些初步实验，以确定最佳的溶液浓度范围。
其次是选择合适的滴定量。
滴定量是指每一次滴加到反应体系中的试剂量。
在进行等温滴定量热法实验时，滴定量的选择将直接影响到实验的敏感性和准确性。
一般来说，滴定量应尽量小，以确保每一次反应的热效应可以被仪器检测到，同时避免反应溶液的剧烈稀释或稀释不足。
通常情况下，滴定量为0.5-2.5 μL。
还需要考虑实验温度和缓冲溶液的选择。
实验温度应根据实验系统的特性和要研究的反应进行合理的选择。
对于生物体系来说，一般选择25℃或37℃作为实验温度。
而对于非生物体系，可根据需要进行调整。
缓冲溶液的选择应该使得反应体系在所选温度下保持稳定，并且不对测量结果产生干扰。
在实施等温滴定量热法浓度优化实验时，以下是一些有效的实践经验和技巧：1. 从简单到复杂地确定浓度范围。
首先可以进行一些初步实验，选择几个不同浓度的溶液进行测试，进而找到适合体系的浓度范围。
可以根据实验结果调整溶液的浓度，并逐渐扩大范围。
2. 手动混匀溶液，确保均匀分布。
在进行实验前，用手动混匀的方法将溶液均匀混合，以确保反应物质在整个试验过程中处于均一的状态。
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
ITC等温滴定量热法的操作说明
ITC等温滴定量热法的操作说明ITC等温滴定量热法的操作说明1：概述ITC（Isothermal Titration Calorimetry）等温滴定量热法是一种常用于测量化学反应热效应和热力学参数的实验技术。
本文档将详细介绍ITC等温滴定量热法的操作步骤，以及常见问题的解决方案。
2：实验前准备2.1 仪器准备- 确保ITC仪器处于良好的工作状态，并进行必要的校准和检修。
- 检查仪器和相关设备的供电和冷却系统，确保正常运行。
- 准备实验所需的试剂和溶液，确保其纯度和浓度符合要求。
2.2 样品准备- 准备待测样品，确保样品的纯度和浓度符合实验要求。
- 储存样品时，注意避免暴露在空气中，以免影响实验结果。
- 如有需要，进行样品的预处理或稀释，以适应实验要求。
3：实验操作3.1 基本操作步骤- 打开ITC仪器，并进行必要的初始化设置。
- 准备试样，通常包括两种液体：溶剂和待测样品。
- 启动实验程序，并按照程序指导添加试样。
- 进行实验过程中，根据实验需要，调整实验参数，如温度、压力、浓度等。
- 当实验结束后，关闭仪器，保存实验数据。
3.2 添加试样的注意事项- 添加试样时，应尽量避免形成气泡，以免影响测量结果。
- 在添加试样前，应将样品和溶剂在相同工作温度下达到热平衡。
- 添加样品时，应使用精确的加样装置，控制加样速度和时间。
4：数据分析4.1 数据处理与解读- 对实验数据进行处理和分析，包括热流曲线的积分和差分操作等。
- 利用数据做曲线拟合，计算反应热和其他热力学参数。
- 根据数据分析结果，解释实验现象和反应机制。
4.2 出现问题的解决方案- 如实验数据异常或与理论不符，可检查实验操作是否正确，并逐步排除可能的问题。
- 如仪器出现故障或异常，应及时联系厂家进行维修或咨询专业人员的意见。
5：附件本文档附带以下附件：- ITX仪器操作手册6：法律名词及注释本文档中涉及的法律名词及其注释如下：- 1：涉及附件: 本文档所附带的相关文件或资料。
ITC(等温滴定量热)培训第一课原理介绍
+
- 焓变和熵变均不利，反应不会自发进行
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ITC 在生命科学和药物研发中的应用
• 分析生物分子的相互作用
– 证实结合以及活性 – 确定化学计量比和热力学参数
• 研究任意两个生物分子的相互作用
– 蛋白，核酸，脂质，药物，抑制剂等 – 结构生物学以及结构-活性间的关系
10 / 29-0301-14 AA
热力学 1(4)
kcal/mole of injectant
0
Ligand A into
-2
compound X
-4
-6
-8
-10
-12
-14
0
Ligand B into compound X
1
2
3
4
Molar ratio
相同的亲和力和化学计量比，但是 不同的焓变 （热量）
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
等温滴定量热法 (ITC) 的介绍
目标
• 等温滴定量热(ITC)的原理介绍 • 介绍焓，熵和自由能的定义，理解生物分子相互作用和分子识
别 • 常用应用的介绍
4 / 29-0301-14 AA
为何使用微量热技术?
无标记
宽广的动态范围
信息丰富
使用方便
• 直接测量热量变 化 (ITC)
这告诉我们不同的结合机制
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热力学 2(4)
DG = RT ln KD DG = DH –TDS
ΔH,焓 （enthalpy），反映氢键和范德华键 的变化
-TΔS, 熵（entropy），反映疏水作用的变化 和/或构象变化
ITC(等温滴定量热)培训仪器操作和疑难解答
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
Time (min)
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pH 不匹配
样品准备
•使用高浓度配体时，i.e. mM 级或以上，可能出现pH 不匹配 •为了防止这个；用酸或碱滴定回要求的 pH， 同时/或者提高缓
样品准备
配体 用透析液稀释一管含DMSO 的配体母液，然后…. 蛋白 在蛋白溶液中加入相应量的DMSO
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从DMSO母液中准备配体
样品准备
5 mM 配体 （100% DMSO）
50 µl
950 µl
透析液
250 µM 配体 （5% DMSO）
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Estimated KD µM
<0.5 0.5-2 2-10 10-100 >100
[Protein] µM
30.00
Time (min)
40.00
50.00
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实验设置和关键问题
实验
•需要多少样品? •什么是理想的运行参数? •该设置什么样的对照实验?
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需要多少样品?
实验
你知道 KD?
是 按照表格进行
No 尝试20 µM 蛋白和 200 µM 配体
用MicroCal™ iTC200 和 MicroCal™ AutoiTC200 获取高质量数据
目标
• 列举为取得高质量数据所需的操作步骤 • 演示样品准备时遵循一些简单的规则的益处 • 举例演示如何优化实验
等温滴定量热仪(ITC)
无需标记、无需检测方法开发，快速获得结果
ITC 是基于复合物形成时所放出或吸收的热量的精确测定，它是在一个实验中能够同时测量所有结 合参数的先进技术。它测量在天然状态下结合伴侣的亲和力，无需使用荧光标签修饰组分或使样品 固定化。 总而言之，ITC 是与众不同的。
Isothermal Titration Calorimetry (ITC) 应用研究领域目录
B
A
0 -2
ऐ ( ∆H)
10 5 փ૧ ∆G ∆H -T ∆S ᆶ૧
kcal/mole ጀ
-6 -8 -10 -12 -14 0 1 ఊܻԲ ࣅბऺଉბ (n) 2 ൕࢅ૰ (K D)
kcal/mole
-4
0 -5 -10 -Байду номын сангаас5 -20
A. ITC 测量热力学性质包括：相互作用的化学计量学（n）、亲和力常数（KD）、焓变化（∆H）、熵变化（∆S）。 B. 利用三个具有相同结合能 （∆G） 的相互作用解释热力学特征。 结合亲和力是结合焓 ( ∆H) 和结合熵 ( ∆S) 的共同作用的结果。 结合焓反映了由于氢键形成和范德华力产生的相互作用强度。结合熵是复合物形成时来自去溶剂化和构象变化的熵变化 的组合。
* 具体应用参考文献查阅可登陆
4
技术优势及应用实例 ：
将药物的先导化合物的优化 带到一个新的水平
更深刻的见解
药物应该以高亲和力和选择性结合目标。传统上，先导化合物的优化一直被剖析亲和力组成的研究 所推动。然而，热力学变量 ( ∆H, ∆S) 也是结合的基础，它们能够提供有关相互作用的更深刻的见解。 MicroCal ™量热仪具有足够的灵敏度和通量用于有效测定先导化合物优化所需的所有结合参数，以 指导先导化合物的优化。
等温滴定微量热仪Nano ITC注意事项
TA仪器等温滴定微量热仪Nano ITC是专为来源有限的、纯的、释释的生物样品的结合与动力学研究设计的。
使用Nano ITC，可以在1纳摩尔或更少量的生物聚合物中检测到低至120纳焦耳的热量。
Nano ITC采用一个固态的热电加热和冷却系统来精确地控制温度，并用独特的抽取式注射器来有效精确的进行滴定。
Nano ITC内置且准确的等温功率补偿设计，能在最快的响应时间（12秒）内进行及时的补偿。
Nano ITC等温滴定微量热仪的高灵敏度测量池是采用99.999%的黄金或哈司特镍碳合金制成，以适应绝大多数化学试剂。
圆锤形的设计不仅使清洗变得容易，而且也使溶液的搅拌更为有效。
Nano ITC等温滴定微量热仪的绝热板封装在密闭真空室中，使得仪器不易受环境变化的影响，温度稳定性可达±0.005℃。
独特的、可移动的抽取式注射器其末端包含一个桨状机械搅拌器，搅拌速度极容易调节，以适应样品的物理性质。
纳瓦ITC的这种整体组装的搅拌装置能够保证样品快速充满、样品清理及精确的滴定。
等温滴定微量热仪性能参数：
最低可检测热量0.1微焦耳
最高可检测热量10,000微焦耳
低噪音水平0.004微瓦
基线稳定性0.04微瓦/小时
温度稳定性25℃时0.005℃
工作温度2～80℃
测量池类型固定圆锥形
样品体积 1.0毫升
响应时间12秒。
等温滴定量热仪(iTC) 原理及操作
谢 谢！
滴定量热法早在1965年由 Christensen和Izatt提出。 该方法最初是用于弱酸-碱和 金属鳌合反应。
1978年，Beaudette和 Langerman首先将微量热法 技术用于生物体系。
等温滴定量热法原理
滴定针
参比池
样品池
等温滴定量热法原理
等温滴定量热法原理
等温滴定量热法原理
微量热法特点
生物技术导论配套实验第六讲之
等温滴定量热仪(iTC) 原理及操作
Łukasz Jaremko et al. Science 2014;343:1363-1366
▪ 等温滴定量热法 (iTC) 测量任何两个生物大分子间的结合亲和力和 热力学参数。
▪ 结合常数 (KD) ▪ 相互作用化学计量 (n) ▪ 焓 (ΔH) ▪ 熵 (ΔS)
1. 直接测量毫摩到纳摩级亲和力 (KDS)（10~2 至 10-9 M） 2. 适用范围广，轻松处理浑浊溶液 3. 非特异性强 4. 真正的溶液内技术 5. 无需标签或固定化，易于操作 6. 样品用量小,方法灵敏度高
研究方向
化学
生物化学与分子生物学
工程学
计算机科学
700
600
500
400
300
200
itc等温滴定量热法
itc等温滴定量热法
ITC (等温滴定量热法) 是一种热学技术，用于测量液相或溶液
中化学反应、相互作用或结合反应的热量变化。
ITC 使用等温操作模式，通过将试剂溶液注入样品细胞中，然
后测量样品细胞中的温度变化，从而确定反应或相互作用发生时的热量变化。
ITC 可以提供关于反应或相互作用的热力学参数，例如焓变、
溶解热、结合热以及反应的热力学常数等。
这些参数可以用于揭示反应机理、评估配体-受体结合亲和力、研究酶动力学等。
ITC 技术在生物化学、药学、材料科学和环境科学等领域具有
广泛的应用。
它可以用于研究化学反应、生物分子的相互作用、药物与靶标之间的结合等。
等温滴定微量热仪(ITC)简介
等温滴定微量热仪(ITC)简介等温滴定量热法在生命科学研究中应用申明：本资料来源于网络，版权归原作者所有！等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
微量热法具有许多独特之处。
它对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独最小可检测热效应0.125uJ，生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 0C - 80 0C，滴定池体积1.43 ml)。
实验时间较短(典型的ITC实验只需30-60分钟，并加上几分钟的响应时间)，操作简单(整个实验由计算机控制，使用者只需输入实验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个实验，再由Origin 软件分析ITC得到的数据)。
测量时不需要制成透明清澈的溶液, 而且量热实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果，这有助于发现新现象和新规律，特别适应于研究生物体系中的各种特异过程。
ITC的用途获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。
ITC的应用范围蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用；……加样体积：（实际体积）cell：1.43 ml，syringe：300 μl准备样品体积（最少量）cell：2 ml，syringe：500 μl样品浓度cell：几十μM到几mMsyringe：几百μM到几十mM测量Kb范围102-1012 M-1滴定实验前恒温30-60 min等温滴定量热实验所需时间，一般1.5-4 hrSample Preparation Guidelines (ITC).Proper sample preparation is essential for successful ITC testing. In particular, the minimal guidelines below must be strictly followed to insure an accurate estimate of stoichiometry (n), heat of binding (H), and binding constant (Kb) (or dissociation constant Kd = 1/Kb).1.) The macromolecule solution (the sample to be placed in the reaction cell) must have a volume of at least2.1 ml. The lowest concentration which can be studied is 3 M and this is adequate only for tight binding where Kd is smaller than 1 M. For weaker interactions, the macromolecule concentration should be 5 times Kd, or higher if possible. Preferably, the macromolecule solution should be dialyzed exhaustively against buffer for final equilibration.2.) The ligand solution (the sample to be placed in the injection syringe) must have a volume of at least 0.7 ml. Its concentration should be at least 10 times higher than the concentration of macromolecule (if the macromolecule has multiple binding sites for ligand, then the ligand concentration must be increased accordingly). The buffer solution in which the ligand is dissolved should be exactly the same buffer against which the macromolecule has been equilibrated.3.) After both solutions have been prepared, the pH of each should be checked carefully. If they are different by more that 0.05 pH units, then one of the solutions must be back-titrated so they are within the limit of 0.05 pH units. If any particles are visible in either solution, they should be filtered out.4.) If possible, the concentrations of both solutions should be accurately determined after final preparation. Accurate determination of binding parameters is only possible if concentrations of binding components are known precisely.5.) At least 20 ml of buffer must be sent along with the two samples, since this is used for rinsing the cell and for dilution if necessary.6.) If possible, DTT should be avoided as a disulfide reagent and replaced by -mercaptoethanol or TCEP.等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍等温滴定微量热仪（ITC）基本介绍（美国MicroCal ，美国微量热公司）仪器设备名称：等温滴定微量热仪制造国别：美国制造厂商：美国微量热公司规格型号：VP-ITC品牌：MicroCal总代理商：华嘉（香港）有限公司技术指标：短期噪音水平：0.5纳卡/秒(2 纳瓦)。
等温滴定量热仪的那些优势 量热仪如何操作
等温滴定量热仪的那些优势量热仪如何操作等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是近年来进展起来的一种讨论生物热力学与生物动力学的紧要方法等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是近年来进展起来的一种讨论生物热力学与生物动力学的紧要方法；它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、精准地监测和记录一个变化过程的量热曲线；原位、在线和无损伤地同时供应热力学和动力学信息。
微量热法具有很多独特之处。
它对被讨论体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件；即具有非特异性的独特优势，样品用量小，方法灵敏度和精准明确度高（本仪器最小可检测热功率 2 nW，最小可检测热效应0.125uJ；生物样品最小用量0.4ug，温度范围2 ℃ —80 ℃，滴定池体积（1.43 ml）。
试验时间较短（典型的ITC试验只需30—60分钟，并加上几分钟的响应时间），操作简单（整个试验由计算机掌控；使用者只需输入试验的参数，如温度、注射次数、注射量等，计算机就可以完成整个试验，再由Origin软件分析ITC得到的数据）。
测量时不需要制成透亮清亮的溶液, 而且量热试验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
尽管微量热法缺乏特异性但由于生物体系本身具有特异性，因此这种非特异性方法有时可以得到用特异方法得不到的结果；这有助于发觉新现象和新规律，特别适应于讨论生物体系中的各种特异过程。
等温滴定量热仪具备了新奇的ITC技术及好的应用弹性，极适合于分子间交互作用之热力学驱动力的表征。
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ITC等温滴定量热法的操作说明解读
ITC提供了（△G）以及（△H） 和（△S），产生了结合机理的真 实图像。
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ITC：用生物相关模型系统架起桥梁
ITC的关键优势之一是创建生物相关实验的独特能力。再没有其他技术 能提供完全无标记且液相的分析环境，同时无需靶点高分子或配体的固 定。ITC的应用在相关模型生物系统的建立和验证中起了重要的作用。
Assessment of biological activity.
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在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。当配体 注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。当池中的 高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
等温滴定量热法
(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)
2011-10-13
Isothermal Titration Calorimetry, ITC
等温滴定量热技术（ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何
化学反应的热力学技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加 入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化
1等温滴定量热法isothermaltitrationcalorimetryitc201110132isothermaltitrationcalorimetryitc等温滴定量热技术itc是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术即用一种反应物滴定另一种反应物随着加入滴定剂的数量的变化测量反应体系温度的变化它通过高灵敏度高自动化的微量量热仪连续准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线原位在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法
等温滴定量热法(ITC)
等温滴定量热技术摘要：生物大分子可以和很多配体特异性结合，当物质结合时，热量要么产生，要么吸收。
生物大分子与配体相互作用的定量描述需要确定反应过程中热力学参数的变化。
相互作用过程中产生的热量变化可以用量热计定量监测。
等温滴定量热技术（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种监测由结合成分的添加而起始的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物分子间相互作用的首选方法。
它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息，如结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）、熵（△S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）。
这些信息提供了生物分子相互作用的真实写照。
由于几乎所有的生化反应过程都有热量变化，所以ITC具有很广泛的应用，它可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞相互作用等方面。
关键字：等温滴定量热技术、相互作用、热力学商业化的测量生物分子相互作用热量的灵敏的量热计出现在上世纪80年代后期[1]。
从此这种技术被广泛应用。
在过去的20年中，等温滴定量热技术（ITC）成为研究相互作用的常用方法。
随着现代ITC仪器的发展，ITC更加灵敏、快速、易用。
分子识别是一个复杂的过程，是生命活动的基础。
生物分子识别过程需要结合反应的热力学参数来阐明。
等温滴定微量量热法可以直接定量检测滴定反应过程中的热量变化，确定反应的结合常数K B 、结合计量比（n）、反应焓变（∆H）、熵变（∆S）、恒压热容（△Cp）和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat ）等热力学参数，用来表征生物分子间的相互作用。
结构化学实验-itc等温量热滴定
一、实验目的：1.了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用2.了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作3.简要分析实验结果。
二、实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数KD、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnKD和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
在恒温下，注射器中的“配体”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。
当配体注射到池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比。
当池中的高分子被配体饱和时，热量信号减弱，直到只观察到稀释的背景热量。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪可以用来定量测定生物分子间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用（包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用）；蛋白质折叠/去折叠；蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；酶促反应动力学；药物-DNA/RNA相互作用；RNA折叠；蛋白质-核酸相互作用；核酸-小分子相互作用；核酸-核酸相互作用；生物分子-细胞相互作用等。
从而获得亲和力以及相关热力学数据。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数KD。
决定曲线形状的主要参数是C值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]t/ KD × NC值越大，曲线越陡；C值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C值在10-100之间实验效果最好。
配体溶液多次次注射到ITC池的蛋白溶液中。
每个注射峰下方的区域的面积与注射所释放的总热量相等。
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–每周使用Plates Clean script 来深度清洁系统，每次使用 pipette进样蛋白或其他粘性物质后使用Plates Syringe Clean 清洁
• 每300 个循环更换活塞头
对策: 确保进样针的密封
18 / 29-0301-14 AA
Abnormal peaks 1(3)
原因:
样品池中无样品
15.00
µ cal/sec
10.00
对策: 检测样品是否加入到了正确的孔中 5.00
0.00
-5.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
Time (min)
16
14 -16.67 0.00 16.67 33.33 50.00 66.67 83.33 100.00 116.67 133.33
Time (min)
23 / 29-0301-14 AA
信号波动1(2)
原因: 粘性蛋白或清洁不够
对策: 用去垢剂清洁样品池 提高参考功率
µ cal/sec
6
4
2
0
MicroCal™ Auto-iTC200 系统
对策: 使用 ‘plates pipette clean‘ 清洁进样针
MicroCal™ iTC200 系统
对策: 用去垢剂然后用水冲洗
原因: 进样针损坏 对策: 更换注射器
16 / 29-0301-14 AA
基线升高
原因：样品池脏 对策: 每次试验后用去垢剂清洁样品池 原因: 管道脏
19 / 29-0301-14 AA
反常峰 2(3)
原因: 滴定间的间隔不够长
对策: 提高滴定间的间隔时间
µ cal/sec
19
18
17
16
15
14 0.00
33.33
66.67
100.00
Time (min)
133.33
166.67
20 / 29-0301-14 AA
反常峰3(3)
原因: 滴定间的间隔不够长
MicroCal™ ITC 系统 培训课程
疑难解答
大纲
数据差的表现 • 不正确的基线位置 • 峰分离 (摆动) • 结合等温线非反曲 • 化学计量比远非1或整数值
15 / 29-0301-14 AA
基线下降
原因: 空样品池
MicroCal™ Auto-iTC200 系统
对策: 样品池加样至少 120 µl 原因: 进样针脏
• 每周更新参比池
28 / 29-0301-14 AA
Time (min)
25 / 29-0301-14 AA
逆转/震动峰
更换活塞头
µ cualc/asle/cs
9.98 9.96 9.94 9.92 9.90 9.88 9.86 9.84
0.00
MESdegas5RAW_CP MESdegas5BASE MESdegas15RAW_CP MESdegas15BASE
对策: 提高滴定间的间隔时间
µ cal/sec
16
14
12
10
8
6
4
2 -8.33
0.00
8.33 16.67 25.00 33.33 41.67 50.00 58.33 66.67
Time (min)
21 / 29-0301-14 AA
基线漂移 1(2)
原因: 粘性蛋白或清洁不够
对策: 用去垢剂清洁样品池
16.67
TTiimmee ((mmiinn))
26 / 29-0301-14 AA
活塞头可能需要更换 – 对策
更换活塞头后
-11 -12 -13 -14 -15 -16 -17
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Run #
27 / 29-0301-14 AA
本章小结
• 定期用去垢剂清洁仪器
µ cal/sec
4
2
0 -33.33 0.00 33.33 66.67 100.00 133.33 166.67 200.00 233.33 266.67
Time (min)
22 / 29-0301-14 AA
基线漂移 2(2)
原因: 粘性蛋白或清洁不够
对策: 用去垢剂清洁样品池
µ cal/sec
MicroCal™ Auto-iTC200 系统
对策: • 仔细清洁管道外面 • 仔细安放板盖防止丢失孔位置和混
入胶
17 / 29-0301-14 AA
反常大的峰
负峰: 该实验的峰值小于0
原因: 甲醇污染
MicroCal™ Auto-iTC200 系统
对策: 更换氮气
原因: 连接/密封不当
MicroCal™ iTC200 系统
-2
-4 0.00
8.33
16.67
25.00
33.33
41.67
50.00
Time (min)
24 / 29-0301-14 AA
信号波动2(2)
原因: 参考功率太低
对策: 提高参考功率
µ cal/sec
2
0
-2
-4
-8.33
0.00
8.33
16.67 25.00 33.33 41.67 50.00 58.33