心肌细胞2

乳鼠心肌细胞原代培养综述

【摘要】

：目的

乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但

是心肌细胞成活率、

搏动率，

纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。

本文

探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。

【关键词】乳鼠

心肌细胞原代培养

1．新生大鼠鼠龄的选择

乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。

2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和

Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。

3．污染防治

虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。

因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，

操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段

除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。 4．心肌细胞纯化

在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力，

且生长迅速，

比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离，

成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想

方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c)

，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine， BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常

规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长，但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长。改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90%以上的心肌细胞

]。离心淘洗:通过各种转子速度和淘洗介质流速的选择对心肌细胞进行纯化，如转速度3 200 r/min，泵速设定20-80 mL/min，在80 mL/min时回收心肌细胞。结果表明：差速贴壁易于实施，对细胞损伤小，但非心肌细胞不能彻底除去，离心淘洗能够得到较为理想的纯化目的，但代价高，梯度离心既便于实施也能较为彻底地除去非心肌细胞。

5．细胞接种密度

分离得到的心肌细胞在接种前，应精细计算细胞数量。若接种数过大，可致过量心肌细胞无法贴壁生长而漂浮，过快耗尽培养液营养成分，影响正常贴壁细胞的生长及观察;若接种数过少，细胞间隙过大，难以进行细胞间信号通讯，不利于心肌细胞生长、产生一致性搏动。同时，不同实验目的对接种细胞数有不同的要求，如用于基因及蛋白表达检测时，细胞接种数可在5~6 105/m，l用于心肌细胞形态观察时，细胞接种数可在1~2 105/ml[3]。

6．换液时间进行心肌细胞形态学观测时。接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少。为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液。这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加。而且BrdU作用时间较长。对成纤维细胞的抑制作用更确实。此外，去血清后可用ITS和0。1 g·L-1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响。之后换不加BRDU的培养液，每两天换一次。

7．培养液PH值控制注意

适宜的pH范围在7。2—7。4之间，配制及使养液时应注意:(1) pH值会在过滤后上升0。1 0。

3。(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关。

(3)应及时换液。(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃。这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升。每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于-20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用。 8．培养心肌细胞存活的形态标志

倒置显微镜下观察刚分离的心肌细胞呈球形; 4h后开始贴壁生长; 19~24h时完全贴壁，细胞呈球形和梭形，以梭形为主，偶见单个细胞搏动。心脏中有多种细胞，但能够产生自发搏动的只有心肌细胞。48h后心肌细胞伸出伪足，且部分细胞间形成交联，这是心肌细胞存活的形态标志。细胞核大且胞浆丰富，立体感明显，折光性强。单个的细胞搏动频率较低，细胞交联后搏动的频率明显增加。

9．应用与讨论心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一，在医学领域有着广阔的应用前景体外培养心肌细胞，可建立多种心肌细胞病理模型，