乳鼠原代心肌细胞培养概要
心肌细胞纯化培养方案——帝沃生物
来源不同，操作人员熟练程度不同，本方案试剂各添加量仅供参考； 4. 本实验最终纯化获取的原代心肌细胞，观察其调动频率、调动幅度以及波峰与波谷时间
间隔等参数值，所使用的设备为 RTCA Cardio(细胞实时无标记多功能分析仪)，如若使 用其他设备检测数据，所获取的数据值参考单位可能与本实验方案有不同，请注意分辨。 5. 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II，都是用 Hanks 液配，是现配现用，直接粉末配制， 分别称好所需的质量，同时溶于 HBSS 中，微孔过滤待用。整个消化过程用的都是此消 化液，即 0.1%的胰蛋白酶和 0.05%胶原酶 II 溶于 HBSS 中配制而成。实验前，称量所需 的胰蛋白酶和胶原酶 II，分别称量好后，放在一起，溶于 HBSS 中，用注射器接上 0.22um 的微孔过滤器，过滤消化液，放入超净台中备用。 6. 本实验方案仅供技术交流之用，实验方案提供者不承担以此实验方案发生的一切事故责 任。
注意：心肌细胞头 2-3 天会抱团，一个集落一个集落地跳，3 天后会慢慢铺开，表现为细
胞团块越来越小，跳动的面积越来越大，到第 4-5 天时可以看到成片跳动，如果种的密度低， 就很难看到成片跳动的景象，多是一个集落一个集落地跳。一般心肌细胞种在塑料基底的培 养皿或培养瓶中，合适的细胞密度下心肌细胞可以从第 2-3 天开始跳动，大约持续到第 4-7 天的，或许更长的时间，而在玻璃基底上（明胶包被）种的细胞有时也能坚持到 7 天，一般 都坚持不了。细胞不聚成一片，细胞纯度可能不够，成纤维细胞等较多，细胞难以连接；心 肌细胞密度较低；细胞的生长状态不好，受到支原体或环境条件的抑制；培养基和血清是否 合适（我们常用 Gibco 10% FBS+Hyclone DMEM），或者这两者存在一些问题，这都是有可 能的。
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养
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病理 、 药理 等方 面 已开 展 了 多项 基 础 研 究 。其 中体 外 培养 的心 肌细 胞 可保 持 结 构 及 功 能 上 的某 些 特
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定
原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定＊程阔菊，黄河，杜智勇，李洪，杨天德△【摘要】目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法，评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。
方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏，台盼蓝染色判断心肌细胞存活率，α－actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。
结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞，台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%，α－actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。
结论严格控制实验条件，可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。
【期刊名称】重庆医学【年(卷),期】2013(000)022【总页数】3【关键词】乳小鼠；心肌细胞；分离；纯化；培养；鉴定各种基因敲除及转基因小鼠已广泛应用于心血管疾病动物模型的建立，已为心血管疾病机制的研究作出了巨大贡献。
体外心肌细胞培养作为一种体外实验研究模型，可以排除神经、体液的干扰而独立地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发生、发展机制，但由于小鼠心肌细胞的分离和培养比较困难，所以一直限制了医学科研工作者在细胞生物学水平上对心血管疾病方面的深入研究。
本实验室在以往的经验基础上，摸索出了一套成熟可行、简单可靠的小鼠心肌细胞培养方法，获得的心肌细胞存活率高且纯度高。
本文对此培养方法做一简单介绍，并对其中的关键影响因素做详细的探讨。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物1～3d龄野生型C57新生乳鼠，SPF级，由第三军医大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（渝）2007－0003。
1.1.2 主要仪器与试剂显微眼用镊、眼科剪、显微镊、显微剪（上海医疗器械有限公司），器械使用前清洗干净并经高压灭菌（121℃，20min）。
二氧化碳培养箱、倒置显微镜（OLYMPUS）、超净工作台（苏净安泰）、低温台式离心机（Sigma）。
小牛血清、DMEM／F12、胰酶、胶原酶Ⅱ（GIBCO），BrdU－溴脱氧尿苷（Sigma），青霉素、链霉素（华美生物工程公司），anti－α－actinin（Millipore），组织固定液（Alphelys），Triton X－100（Amresco），SlowFade Gold antifade reagent with DAPI（Invitrogen），Alexa goat anti－mouse IgG（H＋L）（Invitrogen）。
乳鼠原代心肌细胞培养方法
乳鼠原代心肌细胞培养方法
实验动物
出生1~3天的健康乳鼠（Wistar），雌雄不分。
药品与试剂
DMEM/F12基础培基，Brdu ，胰蛋白酶（1:250），Ⅱ型胶原酶（sigma)，胎牛血清（hyclone），双抗（青霉素-链霉素）
原代心肌细胞培养
1．出生后1~3天的乳鼠，雌雄不分。
将乳鼠在75%乙醇中浸泡5秒左右，于无菌条件下取出心脏，置于平皿中，用PBS溶液反复洗涤3次，并除去大血管及脂肪组织，眼科剪剪碎至约1mm3。
2．用0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.06%的胰蛋白酶在37℃恒温摇床中震荡消化5~7次，每次5min。
收集除第一次之外各次所得的消化液，并及时加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。
（第一次的消化液中含较多血细胞，故弃去，也可视清洗的情况而定）
3．终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块，1000rpm离心10min 收集细胞。
4．离心后弃上清，用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，CO2培养箱差速贴壁1.5小时。
5．收集未贴壁的细胞悬液，重新接种于培养瓶中，前3天加用0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞的生长。
6．培养2~3天，待贴壁心肌细胞连成片状同步搏动后，消化接种于不同的培养板中，供进一步实验用。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
心肌细胞培养
乳鼠心肌细胞培养经验谈1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：胰酶＋胶原酶II混合消化的方法，并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。
还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2.5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。
经验一：总结来说：1.0.08％胶原酶II＋0.125%胰酶等比混合后消化2.消化前后一定要轻柔吹打3.重悬时要充分吹打，动作轻柔（100次）4.种板密度要合适5.当然血清，板都要进口，别图便宜6.别忘了检查CO2温箱的情况2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧，或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。
经验二：1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的，活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的，再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。
2:胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了,处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5%血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。
离心1000转4分钟.3:四季清的胎牛血清,180元一瓶,很便宜,进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱,我建议用进口的.我们用的是15%的浓度.(注意:终止液和培养液浓度是不同的,终止液没必要用那么高浓度,有点浪费),我们用高糖的DMEM,感觉不错.在这里我感觉最重要的培养液的PH值,尽量在7.2-7.4之间,刚开始我们还有仪器测,后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调,大部是高,没有低的.所以NAOH没有用过.4:离心管和瓶最好是用进口的,还要差速贴壁.细胞接种的浓度最好高些,宁可浪费一些.也不要让浓度太低,低了不容易活.这个本人觉得可能是细胞之间会产生某些刺激生长的东西,再说了,不管浓度高低肯定会有一些死细胞存在的,死的细胞对活细胞的生长也是有害的,所以尽量接种浓度要高些。
乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养
１ ３ 实验 仪 器 超 净 工 作 台 （ 海 浦 东 物 理 光 学 ． 上
仪器 厂 ） Ｃ 培养 箱 （ 国 Ｓ Ｅ ＬＬ Ｂ公 司 ） 普 、Ｏ 美 Ｈ Ｌ Ａ 、
通光 学显微 镜 （ 日本 Ｏ ｙ ｕ ） 离心 机 （ 大利 Ａ Ｃ ｌ ｍｐ ｓ 、 意 Ｌ 公 司） 。 等
胎 牛血清 为接 种培养 液 ， 加入 １ ％新 生 牛 血清 为 交 ０
换 培养液 。酶 消化液 ： 将胰 蛋 白酶溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲液 Ｂ （ Ｈ ７ ２～ ． ） ， ｐ ． ７ ４ 中 配成 ０ １ ． ％胰 蛋 白酶 消化 液 ； 将
Ｉ 型胶原 酶 溶 于 Ｐ Ｓ缓 冲 液 （ Ｈ ７２～７４ 中 ， Ｂ ｐ ． ． ） 配 成 ０ ０ ％ 的 胶 原 酶 消 化 液 。０ １ 胰 蛋 白 酶 及 ．８ ．％
１４ 方 法 ．
维细胞 培养 常存 在 污染 、 消化 不 全 和 纯度 不 够 等 现 象 。为此 ， 们 参 照 Ｓｍ ｓｎ等 的 培养 方 法 并 作 我 ｉｐｏ
了改进， 摸索 出一种简便 、 可靠 ， 且同时能培养出心 肌细 胞和心 脏成 纤维 细 胞 的方法 ， 心肌 细 胞 和 心 为 脏 成纤 维 细胞 的 体外 研究 提供 了 更 有 效Байду номын сангаас的技 术 手 段 ， 作报道 。 现
０ ０ ％ Ｉ型胶原 酶 以 ２ １ ．８ ： 混合 ， 配现用 。 现 １ ２ 实验 动物 １～ Ｆ龄 Ｓ ． ３ ｔ Ｄ大 鼠 １ ２ ０～ ５只 ， 由 本 院实验 动物 中心提 供 。
［ 收稿 日期 ］２ ０ －６３ ０９０ －０ ［ 作者单位 ］１蚌埠 医学院 药理学教 研室 ， ． 安徽 蚌埠 ２ ３ ３ ２ 蚌 ３０ ０；． 埠医学 院第一附属医院 心血管 内科 ， 安徽 蚌埠 ２ ３０ ３ ０４ ［ 作者简介 ］张乃菊 （９ １一） 女 ， 士研究生． １８ ， 硕 ［ 通讯作者 ］祝晓光 ， 研究生导师 ， 教授．
乳鼠心肌细胞的培养方法
乳鼠心肌细胞的培养方法摘要细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出,模拟动物体内的生理条件,在体外进行培养.使其不断地生长、繁殖,人们借以观察细胞的生长、繁殖;细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
对乳鼠心肌细胞的培养进行理论和实验探讨。
关键词乳鼠心肌细胞;细胞培养;方法1材料所需液体:Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
试剂:Trypsin,SDS,DMEM均购于SigmaChemicalCo.小牛血清购于杭州四季青生物制品有限公司,其余均为国产分析纯。
取鼠:标准SD大鼠,鼠盆用棉铺好,取鼠。
物品:白大衣、饭盒;小剪子、小镊子(4套)(一套剪皮肤、一套开胸取心,一套剔除心缘纤维组织,一套剪碎心脏);瓶皿(2套);250ml烧杯3个;500ml烧杯1个,用作废液缸;50ml烧杯3个(剪碎心肌组织,最后配液);三角烧杯(50ml)小转子(小转子,酒精擦,双蒸水冲后,再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压);离心管及帽(12-14个),两个试管;吸管(5-8个)大镊子(两把,持物,例夹棉球等);台面:磁力搅拌器、纱布(事先用于托盘装0.1%新洁尔灭浸泡)、试管架、泡沫塑料板、五个针头(不用消毒)75%酒精棉球及碘酒(消毒棉球,泡酒精、碘酒)大镊子两把(一把夹棉球,一把取鼠)、3个250ml烧瓶(一个装一蒸水,一个装新洁尔灭,另一为空的备用)1个500ml烧瓶(废液缸)、温度计、PH试纸(事先调PH值)、酒精灯、打火机/火柴、载玻片(5-10个)、注射器5ml6个(胰酶、DMEM、小牛血清)1ml2个(双抗液)20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml。
以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
事先把显微镜、离心机、磁力搅拌器电源插好。
检查酒精灯是否有酒精,碘酒和酒精棉球是否够用。
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法
原代心肌细胞-原代心成纤维细胞培养方法实验准备：昆明乳鼠25~30只；生物安全柜；巴氏吸管2支；培养皿2个；原代器械盒；15ml 离心管；50ml离心管各一支；胰酶；PBS；1%双抗；封口膜；酒精灯；Dhanks；实验主要分为两大步骤进行：第一天晚上1、培养皿内加入预冷的PBS+1%双抗。
2、取乳鼠酒精喷全身取心脏放到提前准备的培养皿中无需剪碎稍抖动清洗。
3、所有心脏取完，用巴氏吸管将培养皿中的心脏吸到15ml离心管中，稍等沉降，吸去液体。
4、加入Dhanks冲洗心脏，吸出弃去，将心脏上沾有的血尽量冲洗干净。
5、加入3mlDhanks和5ml胰酶。
封口膜封好，放到饭盒里，四度摇床8-12小时。
第二天上午1、配置二型胶原酶（16.8mg二型胶原酶+21mL DMEM,配好后放到水浴锅预热，微孔滤膜过滤，现用现配）2、8-12小时后，向装有心脏的15ml离心管中加入5ml DMEM完全培养基中和胰酶。
之后小心吸去液体，加入7ml提前准备好的二型胶原酶。
放到37度摇床摇10min转速160r，摇10min后将上清吸到新的50ml离心管中。
这个过程重复3次，基本上心脏全部溶解，只有少量组织。
（每次可以少加二型胶原酶4-5ml多消化几次）3、将50ml离心管中3次收得的上清滤网过滤，离心1000r5min，弃上清，沉淀加入DMEM完全培养基，逐层吹起，加入到细胞培养瓶中。
5只鼠铺一个培养瓶。
4、1.5-2小时后差速，将培养瓶中的培养液转移到六孔板里。
心肌细胞10只鼠一个6孔板即可。
注：用心肌细胞的取6孔板中细胞培养48小时；用成纤维细胞的将培养瓶中差速的瓶用1000ul的枪冲洗30次得到的成纤维细胞相对较纯。
小鼠乳鼠原代心肌细胞的改良培养
通讯作者 ：黄莺，博士，
副 主任 医 师 ，副教 授 ，新
疆医科大学第一附属 医院
心 脏 中心 ，冠 ・ ， １ ２ 病木
齐市 ８ ３ Ｏ Ｏ５ ４
中图分类 号： Ｒ ３ １ ８
文 献标 识码 ： Ａ
组 织Ｉ 程 ：飘镪 瞻 心 畦： 小 鼠
Ｍｏｄｉ ｆ ｉ ｅｄ ｐｒ ｉ ｍａｒ ｙ ｃｕｌ ｔ ｕｒ ｅ ｏ ｆ ｎｅｏｎａ ｔ ａｌ ｍｏｕｓ ｅ ｍｙｏｃａ ｒ ｄｉ ａｌ ｃｅｌ ｌ ｓ
Ｍｅ ｎ ｇ Ｌ ｉ ｎ — Ｉ ｉ ｎ ’ Ｈｕａｎ ｇ Ｙｉ ｎ ｇ’ Ｍａ Ｙ ｉ ． ｔ ｏ ｎ ｇ ’Ｌ ｉ ｕ Ｆ ｅｎ ，Ｃｈ ｅｎ Ｂａｎ ｇ— ｄａｎ ｇ 。 Ｃｈｅｎ Ｘｉ ａｏ ． ｃｕ ｉ ， Ｇ ａｉ Ｍｉ ｎ ． ｔ ａｏ
基 金资 助 ：
国家 自然科 学 基金 资勃 项 目【 毽 １ ２ ６ ０ ０ ２ ２ ） ：额 疆维 吾尔 自治 区 自然科 学基 金 资助项 ￣（ ２ ０ １ ４ ２ １ １ Ｃ ０ ４ ０ ）
摘要
文章编 号： ２ ０ ９ ５ ４３ ４ ４
（ ２ ０ １ ５ ） ３ ７ － ０ ５ ９ ９ ３ － ０ ５
稿 件接 受：２ ０ １ ５ － ０ ８ － ０ ７
ｈ ｔ ｔ ｐ： ／ ／ ＷＷＷ ｃ ｒ ｔ ｅ ｒ ． ｏｒ ｇ
背 景 ： 大 鼠心肌 细 胞原 代培 养技 术 日渐 成 熟 ，但 小 鼠心 肌细 胞 在 同样 实验 条件 下不 易获 得 ，而 小 鼠基 因组与 人 类 基 因组有 更 多相似 之 处 ，具有 更 高的研 究 价值 。 目的： 改进 小 鼠乳 鼠原 代心 肌 细胞 的培 养 方法 ，得 到纯 度 高 、活 力强 、保 持心 肌 细胞 原有 结构 和功 能 的心肌
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养娜几娜;王凌鹏;马艳;侯月梅【摘要】目的:观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征.方法:Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法.结果:12 h心肌细胞基本贴壁,第2天可长成单层,第3～4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动呈同步性,收缩明显有力,搏动频率为30～120次/min.结论:用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2008(031)007【总页数】2页(P786-787)【关键词】乳鼠;心肌细胞;培养【作者】娜几娜;王凌鹏;马艳;侯月梅【作者单位】新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,干细胞移植研究中心,新疆,乌鲁木齐,830011;新疆医科大学第一附属医院,心脏中心,新疆,乌鲁木齐,830011【正文语种】中文【中图分类】R-332心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一，目前在心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面已开展了多项基础研究。
其中体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点,并具有自发性节律搏动,且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。
利用培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节,研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景,故引起了人们的高度重视并竞相进行与心肌细胞培养有关的研究[1]。
心肌细胞培养的常见动物是大鼠,常用的细胞培养方法包括新生大鼠心肌细胞的培养和成年大鼠细胞的培养。
为观察原代培养小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征，本研究用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞。
乳鼠心肌细胞培养
大鼠心肌细胞培养一、乳鼠原代心肌细胞培养（一）、试液配制1．DMEM培养液：配制方法同前。
按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。
2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。
3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：（二）、操作步骤１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。
最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。
８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到新的培养瓶中继续培养；11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。
心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。
（三）、注意事项１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。
决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。
２）尽量减少非心肌细胞的存在。
乳鼠心肌细胞原代培养综述
乳鼠心肌细胞原代培养综述乳鼠心肌细胞原代培养综述【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。
本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。
【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养1．新生大鼠鼠龄的选择乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。
2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。
消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。
其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。
所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。
另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。
且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。
61 g·L-1，我们使用的为0。
8 g·L-1。
胶原酶最好现用现配。
3．污染防治虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
乳鼠心肌细胞培养(自己总结)
15-20 只动物用 200ml 消化液。
另记住加双抗
如想加胶原酶，则 100ml 需胶原酶 II 110mg
3．注意事项: a. 1 次最多养 20 只【每 T25 需 1.2 只乳鼠（1-3 天）】 b. 酒精需浸泡乳鼠两次消毒 c. 消化时间不能超过 16 次，8 次以内最佳
试剂
200ml
250ml
Trypsin
0.16
0.2
NaCl
1.6g
2
NaHCO3 葡萄糖
0.0706g 0.1982g
0.088 0.24775
KCl
0.0596g
0.0745
HEPES
0.4
0.5
ddH20
200ml
250ml
完成后，用 0.22μm 滤器过滤除菌（现用现配）
用加转子的瓶搅拌 1hr 后用 0.22μm 滤器过滤除菌。5-10 只 动物用 100ml 消化液，
＞1 个滤器 3 个玻璃平皿 吸管
试剂 PBS 溶液
含 10%FBS 的 乳鼠心肌细胞
DMห้องสมุดไป่ตู้M
消化液
数个塑料平皿
恒温磁力搅拌 器
二．实验步骤： 1. 超净台紫外线照射 30 分钟，3 个平皿中加适量的 PBS，4 个 50ml 离心管中各
加 10ml 含 10%FBS 的 DMEM；用 75％酒精消毒乳鼠后，左手捏住其颈部， 伸长其躯干，剪刀从剑突左缘剪开胸骨，暴露心脏后用镊子夹出置于 PBS 中 清洗。 注意：酒精中不要混有杂物，拿取酒精泡过后的乳鼠时，尽量不要碰其心胸 部，以防污染。 2. 将清洗后的心脏置入另一个平皿中小心尽可能多的除去结缔组织，收集心脏 用剪刀剪碎：左手弯镊在心房口处夹住，右手直镊摘取多余结缔组织。 3. 加 10ml 消化液后用吸管移至刻度瓶中，37 度水浴调节到适当的转速。头二个 8 分钟消化后，弃去上清，第三个 8 分钟收集的消化后的上清转移至含 10ml10%FBS 的 DMEM 的 50ml 离心管中。此后每 8 分钟收集一次。每次加 10ml 消化液。当消化后的上清变成近似于无色澄清后可以终止消化。 4. 收集的消化液离心 1200rpm，12 分钟，25 度（室温）。弃去上清，加适量含 10％FBS 的 DMEM，260 目滤器过滤后进行差速贴壁。(每 T75 瓶 12ml,3 瓶
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
小鼠心肌细胞的原代培养注意事项
一、实验前准备
1.1 材料准备
1.2 设备准备
1.3 环境要求
二、小鼠心肌细胞的原代培养操作步骤
2.1 小鼠心肌细胞的分离和培养基的配制
2.2 小鼠心肌细胞的原代培养
三、培养基的更换和维护
3.1 培养基的更换
3.2 细胞状态观察和维护
四、实验中常见问题及解决方法
4.1 细胞污染问题及解决方法
4.2 细胞生长不良问题及解决方法
4.3 细胞死亡问题及解决方法
五、实验安全注意事项
5.1 实验室安全措施要求
5.2 实验过程中个人防护措施要求
六、实验结果的分析和记录方式
6.1 实验结果的观察和记录方式
6.2 数据处理和结果分析方法
七、实验结束后处理方式
7.1 培养皿、试管等废弃物处理方式要求7.2 试剂废弃物处理方式要求。
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乳鼠原代心肌细胞培养概要作者：何伟， 张明雪， 闫丽娟作者单位：何伟(辽宁中医药大学,辽宁省沈阳市,110032)， 张明雪,闫丽娟(辽宁中医药大学附属医院)刊名：实用心脑肺血管病杂志英文刊名：PRACTICAL JOURNAL OF CARDIAC CEREBRAL PNEUMAL AND VASCULAR DISEASE年，卷(期)：2009，17(4)引用次数：0次1.郭军.鲍翠玉.林国生.杨波新生大鼠心肌细胞培养方法的改进[期刊论文]-心血管康复医学杂志 2006(6)2.邵华.金秀东.梁军.张际绯.刘瑞峰不同差速贴壁时间对心肌细胞培养的影响实验性研究[期刊论文]-牡丹江医学院学报 2008(1)3.王涛.余志斌.谢满江.车红磊新生大鼠心肌细胞培养技巧[期刊论文]-第四军医大学学报 2003(2)1.期刊论文谭玉珍.王海杰.TAN Yu-zhen.WANG Hai-jie生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征-解剖学报2009,40(4)目的 观察生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征,建立理想的分离和纯化乳鼠心肌细胞技术. 方法 采用胰蛋白酶消化和机械分离,结合两次差速贴壁法以及使用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),从生后1～7d乳鼠心脏分离和纯化心肌细胞.观察细胞的形态和自发性搏动,并用心肌特异性肌钙蛋白丁(cTnT)免疫细胞化学染色进行鉴定.利用原位透射电镜术观察细胞超微结构,并观察其对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应. 结果 从乳鼠心脏分离的细胞95%以上为心肌细胞,存活率为95%以上.乳鼠心肌细胞包括短柱状或杆状细胞和不规则形细胞.生后1～3d鼠大部分杆状细胞呈现幼稚心肌细胞的超微结构特征.6～7d鼠的杆状细胞具有类似于成熟心肌细胞的超微结构特征,cTnT呈高表达,横纹明显.不规则形细胞含有少量肌丝束,排列不规则.少数体积较小的细胞呈现未分化细胞的超微结构特征.培养72h后80%以上的细胞出现自发性搏动.肾上腺素和异丙肾上腺素刺激后,搏动细胞数目增多,搏动增强.生后6～7d鼠杆状细胞的药物反应较强. 结论 两类心肌细胞的超微结构特征、自发性搏动和对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应不同.生后6～7d鼠心肌细胞较适合于成熟心肌细胞的体外实验研究.本实验建立的方法 是一种较理想的乳鼠心肌细胞培养方法 .2.学位论文张昱第一部分：硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用;第二部分：硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用2009研究一硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用 背景： 新型气体信号分子一硫化氢(H2S)在心血管系统主要具有舒张血管，开放心肌细胞ATP敏感钾通道、抑制L型钙通道而产生的负性心肌收缩力的效应。
外源性H2S在器官水平已被证明可能是缺血缺氧心脏的强效保护剂，为临床治疗缺血性心脏病提供一个新的思路。
目的： 本实验主要研究不同浓度的硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧损伤的直接影响，探讨其对缺氧心肌细胞有效的保护浓度。
方法： 原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为正常对照组(C组)和缺氧处理组。
在缺氧处理组又根据培养液中NaHS的终浓度分为0μmol/L(S0组)、100μmol/L(S100组)、200μmol/L(S200组)、400μmol/L(S400组)和800μmol/L(S800组)5个组。
缺氧48 h后各组均检测：细胞存活数量、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。
结果： 与S0组比较，S100组、S200组、S400组缺氧后心肌细胞存活数量均升高(P<0.01)，培养液中LDH活性均降低(P<0.05)，差异均有统计学意义。
S800组较S0组缺氧后心肌细胞存活数量和培养液中LDH活性的差异无统计学意义(P>0.05)。
结论： 100μmol/L—400μmol/L NaHS对缺氧心肌细胞具有较好的保护效果，而高浓度800μmol/L NaHS对缺氧心肌细胞已不具有保护作用。
研究二硫化氢对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用 背景： 离体心脏的保存移植实际是一个冷缺血/再灌注的病理生理过程，影响着移植手术的成败。
新型气体信号分子一硫化氢(H2S)可通过预适应或后适应启动心肌内源性保护机制缓解心肌的缺血/再灌注损伤，是一种有前景的心脏保存液添加剂。
目的： 研究不同浓度的硫化氢(H2S)对缺氧不同时间的乳鼠心肌细胞损伤的直接影响及其对复氧损伤的间接影响，分析其对乳鼠心肌细胞缺氧—复氧损伤的保护作用。
方法： 原代培养的乳鼠心肌细胞随机随机分为正常对照组和缺氧处理组及缺氧/复氧处理组。
正常对照组分为与缺氧处理组正常对照的C1组和与缺氧/复氧处理组正常对照的C2组。
缺氧处理组又根据缺氧液中NaHS的终浓度分为0μmol/L(H0组)、100μmol/L(H100组)、200μmol/L(H200组)和400μmol/L(H400组)的4个组。
缺氧/复氧处理组亦根据缺氧液中NaHS的终浓度分为0μmol/L(R0组)、100μmol/L(R100组)、200μmol/L(R200组)和400μmol/L(R400组)的4个组。
在缺氧24 h、48 h、72 h后及复氧2h后均检测：细胞存活数量、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性。
结果： H100组、H200组、H400组缺氧培养24 h、48 h和72 h后与各自时间点H0组比心肌细胞存活数量升高(P<0.01)、培养液中LDH活性降低(P<0.01)，差异均有统计学意义；H200组和H400组在缺氧培养24 h后较缺H100组心肌细胞存活数量升高(P<0.05～0.01)、培养液中LDH活性降低(P<0.05～0.01)，差异均有统计学意义。
R100组、R200组、R400组缺氧培养24 h、48 h、72 h并复氧2h后较各自时间点缺氧/复氧RO组比缺氧/复氧心肌细胞存活数量升高(P<0.01)、复氧后心肌细胞LDH漏出量降低(P<0.01)，差异均有统计学意义。
结论：100μmol/L～400μmol/L NaHS对缺氧/复氧心肌细胞具有保护效果。
200μmol/L～400μmol/L NaHS对缺氧24h的心肌细胞保护作用较好。
3.期刊论文李波.杜丽娟.王艳丽.孙智睿.徐长庆.张伟华缺血预适应对大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌损伤的保护作用-齐齐哈尔医学院学报2008,29(4)目的 探讨缺血预适应对乳鼠心肌细胞缺血/再灌损伤的保护作用.方法 复制大鼠乳鼠心肌细胞培养模型,试验分为四组:正常对照组:正常培养乳鼠心肌细胞;缺血再灌注组:缺血3h,再灌注9h;预适应组:先缺血90min,再灌注60min,再缺血3h,再灌注9h; 预适应加caffeine组:缺血90min,再灌注20min后加入caffeine 继续缺血40min后,再缺血3h,再灌注9h.分别测定乳鼠心肌细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;HE检测各组心肌细胞损伤情况.结果 检测乳鼠心肌细胞培养液中LDH活力、MDA水平和SOD活力时发现,缺血再灌注组和预适应加caffeine组的培养液中LDH 活力、MDA水平与对照组相比明显增加,而SOD活力与对照组相比则是降低.培养的乳鼠心肌细胞的HE染色可见缺血再灌注组细胞体积变小,胞核浓缩,胞质嗜酸性增强,其病理学改变比预适应组和预适应加caffeine组严重.结论 缺血预适应对大鼠乳鼠心肌细胞缺血/再灌损伤有保护作用.4.期刊论文曾琳琳.张晓刚.胡波.张巧英.郑文武.ZENG Lin-Lin.ZHANG Xiao-Gan.HU Bo.ZHANG Qiao-Ying.ZHENG Wen-Wu高糖对体外培养的乳鼠心肌细胞脂代谢的影响-中国动脉硬化杂志2006,14(8)目的 探讨高浓度葡萄糖对高胰岛素水平作用下乳鼠心肌细胞脂代谢的影响.方法 用胰岛素抵抗心肌细胞模型,以不同浓度葡萄糖培养基和胰岛素为干预因素进行实验.以脂蛋白脂肪酶的表达来观察心肌细胞脂代谢的改变;用电镜观察心肌细胞的病理性损伤. 结果 80 mmol/L葡萄糖作用下,胰岛素抵抗糖作用下,相同状态心肌细胞脂蛋白脂肪酶活性及脂质含量无显著性差异(P＞0.05);相同浓度葡萄糖作用下,胰岛素抵抗心肌细胞脂质含量明显增加(P＜0.05),加用10-8 mol/L胰岛素共同孵育后,细胞脂质含量减少.高浓度葡萄糖作用下,正常心肌细胞和胰岛素抵抗心肌细胞出现线粒体肿胀,髓样结构形成,胞内脂滴增多等细胞结构损伤性改变,加用10-8 mol/L胰岛素共同孵育后,细胞线粒体无增多及肿胀,胞内脂滴减少. 结论胰岛素抵抗心肌细胞脂蛋白脂肪酶表达上调,脂代谢加速,细胞内脂质含量增加,脂蛋白脂肪酶mRNA表达强度增加,细胞结构发生变化,而较高胰岛素水平可逆转这些变化的发生.5.学位论文何婷几种多酚类化合物及其多甲基衍生物对正常和氧化损伤的大鼠心肌和乳鼠心肌细胞的作用2008 多酚类化合物广泛存在于众多植物中，是中药和药食两用植物的重要有效成分，受到医药界的高度关注。
多酚类化合物如白藜芦醇（RES）、槲皮素（QUE）等的药理作用非常广泛，如降血压、抗氧化、抑制脂质过氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肿瘤、抗菌等作用都已有报道。
多酚类化合物化学性质不稳定、生物利用度低、效价低、半衰期短等缺点也防碍了其开发利用。
多甲氧基黄酮是多酚类黄酮的甲基衍生物，具有明显的药代学特点和药效学优势。
但天然多甲氧基黄酮的提取工艺至今无重大突破，得量有限，价格昂贵，使深入研究难以进行，我们对QUE进行了甲基化改造，获得高纯度低价位的五甲基槲皮素（PMQ），全新合成了反式三甲基白藜芦醇（trans-TMR）和顺式三甲基白藜芦醇(cis-TMR)，克服了药源的瓶颈。
本实验拟比较研究PMQ和QUE对正常及H2O2损伤离体大鼠心肌生理特性的影响及其机制，以及比较研究QUE和PMQ，RES、trans-TMR和cis-TMR在乳鼠心肌细胞的抗氧化损伤作用并探讨其可能的作用机制。
第一部分比较研究槲皮素和五甲基槲皮素对离体大鼠心肌生理特性的影响 目的：比较槲皮素和五甲基槲皮素对心肌生理特性的影响。
方法：记录离体大鼠左、右心房肌和心室乳头肌收缩张力、有效不应期、右心房自律性，观察槲皮素和五甲基槲皮素对这些参数的影响。
结果：（1）0.1％DMSO对各指标均无明显作用；（2）PMQ 3，10，30，100 μmol·L-1，QUE 3，10，30，100 μmol·L-1均能增强大鼠离体乳头肌、左心房肌、右心房肌收缩力（P<0.05），随着浓度的增高，其正性肌力作用增强，且同浓度的PMQ比QUE的正性肌力作用弱（P<0.05）；（3）PMQ 10，30，100 μmol·L-1，QUE 10，30，100 μmol·L-1均能增加右心房的自动收缩频率(P<0.05)，随着浓度的增高，其正性频率作用增强，同浓度的PMQ比QUE的正性频率作用弱（P<0.05）；（4）PMQ100 μmol·L-1能缩短左心房肌，心室乳头肌的有效不应期（P<0.05）；QUE30，100 μmol·L-1能延长左心房肌，心室乳头肌的有效不应期（P<0.05）。