心肌细胞培养

乳鼠心肌细胞培养经验谈

1. 心肌细胞搏动差，取材后2、3天细胞活力明显下降：

胰酶＋胶原酶II混合消化的方法，并且每次消化前都轻柔的吹打让组织充分和消化液混合，消化后也充分吹打后静置1－2分钟再吸上清，最后离心完成后，用培养基重悬沉淀是要充分吹打，以避免再下一步过滤时大量的丢失细胞。还要保证种板的密度，一般24孔板我们用2.5×105，每孔1ml，这样24h后就可以很漂亮的看到细胞搏动了，一般72h后搏动就是统一的频率了。

经验一：

总结来说：

1.0.08％胶原酶II＋0.125%胰酶等比混合后消化

2.消化前后一定要轻柔吹打

3.重悬时要充分吹打，动作轻柔（100次）

4.种板密度要合适

5.当然血清，板都要进口，别图便宜

6.别忘了检查CO2温箱的情况

2.消化时总是出现冻冻状东西啊,吸时会把组织快吸走：

胶冻样的东西应该是组织间未消化掉的胶原吧，或消化后的碎细胞ＤＮＡ．用ＤＮＡ酶消化后就没了。

经验二：

1:首先是选择乳鼠时最好是出生3天内的，活力是较好的,皮肤看起来是暗红色的，再大一点的话,皮肤变厚，变白，不过也能养活，而且1个25CM2的培养瓶3只足够了，当然这里说的是SD的。

2:胰酶加胶原酶消化，消化过程中出现絮状物，可能是消化有些快了,处理：如果样品足够多就可以将之丢去；样品少的话，可以先将所有的样品吸入另一新的离心管，重新在这个管字消化，将细胞悬液用5%血清培养液中止消化，而且一定得尽快中止，离心后再中止一次即可。离心1000转4分钟.

3:四季清的胎牛血清,180元一瓶,很便宜,进口的没用过,我们隔壁有人用2000元一瓶.这个和老板有没有钱有关系,要是有钱,我建议用进口的.我们用的是15%的浓度.(注意:终止液和培养液浓度是不同的,终止液没必要用那么高浓度,有点浪费),我们用高糖的DMEM,感觉不错.在这里我感觉最重要的培养液的PH值,尽量在7.2-7.4之间,刚开始我们还有仪器测,后来就观察颜色了,觉得不行就用HCL或NAOH调,大部是高,没有低的.所以NAOH没有用过.

4:离心管和瓶最好是用进口的,还要差速贴壁.细胞接种的浓度最好高些,宁可浪费一些.也不要让浓度太低,低了不容易活.这个本人觉得可能是细胞之间会产生某些刺激生长的东西,再说了,不管浓度高低肯定会有一些死细胞存在的,死的细胞对活细胞的生长也是有害的,所以尽量接种浓度要高些。

心肌细胞培养最好的培养基相关问题讨论总结

乳鼠心肌细胞培养培养基可以用EMEM,MEM,DMEM,M199,MCDB107液,DMEM/F12液，其中以DMEM/F12液最佳，ph值为7.2-7.4。

DMEM/F12养原代心肌，依赖于开始养的细胞状态。DMEM/F12可能开始会使细胞状态可以，提前拨动，但也会让细胞提前老化，所以很难控制最佳状态，提高血清会提高细胞的贴壁率，当然也会带来成纤维的干扰，事实上有点成纤维，心肌会长的更好。HG-dmem+10%FBS养，感觉状态比较好控制，次日下午就可以看到跳动，第三天同步搏动就可以开展实验了，之后细胞呈老态化，数目减少，成聚，个个像个会搏动的向日葵。

原代心肌细胞培养（不用胶原酶并且消化次数不多）

主要用品：

WISTAR乳鼠,出生2天6只

一把弯摄，两把剪子，200目滤网，康宁塑料培养瓶，冰台

高糖DMDM（HYCLONE），四季青胎牛血清（10%），sigma胰酶（1：250，0.25%,PBS 配制，PH约7.0)，国产BRDU

1.用洒精棉擦干净乳鼠后拿入超净台，再将鼠放入洒精中泡几秒后拿出，用眼科剪在胸骨左侧约第6肋间剪开胸骨（不要剪开腹腔），心脏可跳出，在收缩时剪下，放入含预冷的PBS 平皿内（置于冰台上），用洒精棉擦净剪子上的血迹过火后处理下一只。

2.剪除心脏上的大血管心房部分，将心室肌移入另一装有预冷PBS的平皿内，每个心脏剪成两半，在PBS里洗干净，移入另一小烧杯内，剪成0.5-1mm3小块，PBS冲洗3次

3.加入预热胰酶5ML，转移入50毫升离心管内，用3ML一次性吸管（短粗口的）软柔吹打2-3次，放入37度培养箱（无CO2）中，每2分钟振摇一次，5分钟后拿出，在超净台内吹打100次，沉淀一会后弃上清

4.再加入5ML胰酶置离心管内，重复步骤3，将此次上清放入预先分装的5ML完全培养基（10%FBS高糖DMEM），吸管吹打液体100次充分混均而且带入的少量组织块也可分散，放入4度冰箱中，（除第一次弃上清外，再消化3-4次便可消化完全）

5.将收集的上清液于200目滤网过滤后离心（1100转5MIN，离心机半径约15CM），重悬，分2个25CM2的培养瓶中，差速贴1.5小时，用瓶内的培养液轻轻吹瓶壁2次，转移到另外2个培养瓶内，加5-BRDU（终浓度0.1MMOL/L）

6.48小时换液,可同步搏动，（只有细胞之间可以连接的时候才会同步搏动，细胞数少时就自已跳自己的）

小结：

1.消化非常关键，时间不可太长，胰酶浓度我用0.1,0.2%时消化次数太多，细胞活力不好。消化后的吹打是消化次数减少的关键，吹打完的上清一定要快速转移，否则会消化过度。

2.消化时要用底大点的容器，我用过15ML的离心管，组织都堆在管底了，摇都摇不动

3.冰台，可以保证细胞活力

4.消化后会有胶状物连着组织块，上清不易吸出，可以先把这种东西吸出，管里就剩上清了。

5.离心机的转数，文献上多少的都有，但是都没提半径是多少，一般离细胞200-300G。

原代心肌细胞培养技巧

1新生大鼠鼠龄的选择

新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳。

2消化酶的选择及使用

新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g/L,我们使用的为0.8 g/L.胶原酶最好现用现配.

3消化程度的把握

新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增