原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是一种重要的细胞类型，对于心脏生理学和病理学研究具有重要意义。
在研究心脏疾病发生发展机制、药物筛选及分子生物学研究中，大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是必不可少的步骤。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）动物：健康的大鼠（2）工具：手术刀、剪刀、镊子、针头、离心管、培养皿等（3）试剂：PBS、Hanks液、COLLAGENASE、TRYPSIN、DNA酶I2. 心肌细胞的分离（1）准备心肌组织：选取健康的大鼠，进行心肌组织的分离。
将动物取出心脏，迅速放入含有PBS的离心管中，冷藏备用。
（2）组织的机械分离：将心脏取出后进行机械分离，去掉多余的结缔组织等。
（3）酶消化：将组织加入COLLAGENASE、TRYPSIN等酶进行消化，使细胞释放。
（4）滤网过筛：将酶消化后的组织经过滤网过筛，得到心肌细胞的悬液。
（5）细胞纯化：使用密度梯度离心法或其他方法对心肌细胞悬液进行纯化，得到较纯的心肌细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定（1）显微镜观察：将得到的心肌细胞悬液放入培养皿中，通过显微镜观察心肌细胞的形态。
（2）心肌细胞的特征：心肌细胞具有两个或多个横纹和中央的单核的细胞核，且具有特殊的形状和排列方式。
2. 免疫细胞化学鉴定（1）选取适当的心肌细胞标记物：如肌球蛋白、酸性肌球蛋白等（2）进行免疫细胞化学染色：使用特异性抗体对心肌细胞进行染色，观察标记物的表达情况。
（3）通过显微镜观察：观察心肌细胞的染色情况，以确定其特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）培养基配方：DMEM/F12培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素+适量营养因子（2）pH值调节：将配制好的培养基进行pH值调节至7.42. 大鼠心肌细胞的培养（1）培养皿涂层：将培养皿内涂覆明胶或胶原等基质蛋白，有利于细胞的附着生长。
原代细胞分离培养鉴定2(SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞)
原代细胞分离培养鉴定（SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维细胞）目录 3 原代分离——SD 大鼠心肌细胞的分离4 原代分离——SD 大鼠心肌成纤维细胞的分离SD 大鼠心肌细胞、心肌成纤维的分离目的与意义（心肌细胞）心肌细胞体外培养可以为心肌细胞生理、药理及心血管相关研究提供有效、稳定的实验模型，在医学领域有着广泛的应用前景。
体外培养的心肌细胞可保存其形态结构和功能上的某些特点，同时去除了体内外各种限制因素的影响 , 具有精确和重复性好等优点, 可广泛用于心肌结构、病理生理、电生理、药理及毒理、受体及作用机制、心室肌细胞损伤模型及药物保护等的研究。
其次，大鼠动物模型广泛用于心血管系统疾病的基础研究。
目的与意义（心肌成纤维细胞）心脏由心肌细胞和非心肌细胞组成。
非心肌细胞占细胞总数的 70%，其中 90%以上的非心肌细胞由心肌成纤维细胞组成。
近年来，人们逐渐了解到非心肌细胞不仅对心肌细胞具有结构上的支持、保护作用，而且还具有自分泌和旁分泌功能，影响心肌细胞的结构和生理功能，与风湿性心脏病、心肌炎、心肌肥厚、慢性心肌缺血、心肌梗死、炎症等病理状态均密切相关，因此 ,对心肌成纤维细胞的生理学研究成为现代心血管领域研究的一个重点。
心脏 大鼠的心脏位于胸腔内，两侧隔心包与左、右肺紧邻，背侧有气管、支气管和食管。
腹侧借较宽的胸心包韧带和胸骨相连，腹前方与胸腺相贴，后面靠近膈。
C腹侧面B A心肌细胞根据组织学特点、电生理特性分为两类：工作细胞：普通心肌细胞：如心房肌细胞、心室肌细胞，无自律性，主要执行收缩功能；自律细胞：特殊分化的心肌细胞，组成心脏特殊传导系统，如窦房结细胞，收缩功能基本丧失；DESD Rat心脏HE染色F7心肌成纤维细胞 1、 心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts ，CFS)遍布于心肌组织，包绕心肌细胞并连接心肌细 胞间质。
CFS 参与细胞外基质的合成和沉积，与心脏发育、结构、细胞信号系统、物质代 谢等密切相关；它还可与心肌细胞、其它CFS 甚至内皮细胞之间相互接触，影响电机械功 能、细胞因子分泌和血管生成。
新生SD大鼠心肌细胞的原代分离和培养
模型。
１ 实 验 材 料 １．１ 实 验 动 物 。出 生７２ｈ内 的 ＳＤ 大 鼠 ，购 自 南 通 大 学 实 验 动 物 中 心 。 １．２ 主 要 试 剂 。Ｌ－ＤＭＥＭ、Ｂｒｄｕ、胰 蛋 白 酶 、胶 原 酶 Ⅰ 、胎 牛 血 清 。
２ 实 验 方 法 ２．１ 心 肌 细 胞 的 分 离 培 养 。取 出 生７２ｈ内 的 ＳＤ 大鼠 ，７５％ 酒 精 浸 泡 消 毒 ，颈 椎 脱 臼 致 死 ，于 超 净 工 作 台 内 快 速 打 开 乳 鼠 胸 腔 取 出 心 脏 ，置 于
体 外 培 养 的 原 代 心 肌 细 胞 具 有 良 好 的 节 律 性 和 收 缩 性 ，且 不 受 体 液 、神 经 等 体 内 多 种 复 杂 因 素 的 影 响 ，被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾 病 的 发 病
机 理 以 及 药 物 治 疗 机 制 的 研 究 。 ［１，２］ 但 心 肌 细 胞 再 生 能 力 差 ，不 能 传 代 ，
且 易 受 其 他 非 心 肌 细 胞 的 污 染 。到 目 前 为 止 ，心 肌 细 胞 的 体 外 培 养 技 术
仍 存 在 一 定 的 缺 陷 ，限 制 了 各 种 体 外 心 肌 实 验 模 型 的 理 想 建 立 。 本 实 验
采用 胰 蛋 白 酶 和 胶 原 酶 Ⅰ 联 合 消 化 的 方 法 ，获 得 了 具 有 较 高 存 活 率 和 搏 动性 研 究 提 供 可 靠 的 实 验
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健 康 之 路 ２０１６ 年 ９ 月 第 １５ 卷 第 ９ 期 Ｈｅａｌｔｈ ｗａｙ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１６ Ｖｏｌｕｍｅ １５ Ｎｏ．９
新生 ＳＤ 大鼠心肌细胞的原代分离和培养
胡 君 熊存全 周红成 吴争鸣
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞是心肌细胞的主要来源之一，在心脏疾病的研究中具有非常重要的作用。
为了开展相关研究，需要对大鼠心肌细胞进行分离鉴定以及培养，以下是一份详细的操作
步骤。
1. 器材准备
（1）无菌试剂：试剂瓶/管、离心管、移液器、细胞培养基等。
（2）消毒器材：无菌吸管、离心机、高压灭菌器、悬浮液制备仪等。
（3）实验器材：显微镜、培养箱、细胞计数板、细胞离心机等。
2. 心肌细胞的分离
（1）准备新鲜的大鼠心脏组织。
（2）将心脏组织放入离心管中，加入PBS洗涤1-2次。
（3）将心脏组织切成小块，加入预先调配好的组织消化液（如DMEM/F12加入胰蛋白酶），37℃放入恒温水浴中消化2-3次。
（4）将消化的样本离心，去除上清液，加入预备的培养基，悬浮细胞。
（5）进行筛选，并将心肌细胞分离，最终得到心肌细胞。
（1）将分离好的心肌细胞放置在显微镜下观察其形态。
（2）进行免疫荧光染色，使用特定的心肌细胞抗体进行染色，观察细胞核及膜表达，判断其是否为心肌细胞。
（1）将鉴定好的心肌细胞放入预备好的细胞培养基中。
（2）放置于37℃恒温培养箱中，维持培养基液位。
（3）每2-3天更换一次新的培养基。
以上就是大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的操作步骤，具体操作时应注意操作规范
和实验安全，保证实验结果的准确性和可靠性。
新生大鼠心肌细胞原代培养方法
（ ． ０ ９ Ｍ ｓ ｒ ｄ ｇｅ ａ ｄｄ ｔ ｏ Ｔａ ｊ ｎｖ ｒ ｔ ｏ Ｔ ａ ｉｏ ａ Ｃ ｉｅｅＭｅ ｉ ｎ ，ｉｎｉ ３ ０ ９ ： ． １ ２ ０ ａ ｔ — ｅｒｅＣ ｎ ｉａ ｆ ｉ ｉ Ｕ ｉｅｓ ｙ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌ ｈ ｓ ｄ ｉｅ Ｔ ａ ｊ ０ １ ３ ２ ｅ ｅ ｎｎ ｉ ｉ ｎ ｃ ｎ
原 代 心 肌 细 胞 培 养 技 术 被 广 泛 应 用 于 心 血 管 疾病 的研 究 之 中 ， 有 操 作 简 便 、 济 、 重 复 性 等 具 经 可
拘 。由天 津市 山川 红 实 验 动 物科 技 有 限 公 司 提供 ， 动物合 格证 号 ：０ ４ ３ 。 ０ ０ ０ ６
优点 ， 同时排 除 了神 经 、 液 等 因素 的干 扰 ， 可 从 体 并
Ｔａ ｉ ｉｅｓｔ ｆ ｒｄｔ ｎ ｌＣ ｉｅｅ Ｍｅ ｉｉｅ Ｔ ａ ｉ ０ １ ３） ｉｎｉ Ｕｎｖ ｒｉ ｏ ａ ｉｏ ａ ｈｎ ｓ ｄｃｎ ， ｉｎｉ ３ ０ ９ ｎ ｙ Ｔ ｉ ｎ
【 ｓ ａｔ ０ｂｅｔ ｅ ｏｅｐｏｅｔｅｍ ｔｏｓ ｆｈ ｒ ａｙｃｌ ｒ ｏ ａ ｉ ｙ ｓｆ ｅｓｃ ｉｇ Ａｂｔ ｃ】 ｒ ｊｃｉ Ｔ ｘｌｒ ｈ ｅ ｄ ｅｐ ｍ ｒ ｕｔ ｅ ｆ ｒ ｏ ｔ ０ ｔ ｕ ｋ ｖ ｈ ｏｔ ｉ ｕ ｃ ｄ ｃ ｅ ｒｈ ｎ
二、 实验 方法
１ 实 验动 物 ： ｄ内的 Ｗｉ ａ 新 生 大 鼠 ， 雄 不 ． ３ ｓｒ ｔ 雌
基 金 项 目 ： 家 自然 基 金 资助 项 目（ ｏ ８０ ２ ６ ） 国 Ｎ ． １７ ９ ５
作者单位 ：． １ 天津 中医药大学 ２０ ０ ９级硕士研究 生 ， 天津 ３０ ９ ； ． ０ １３ ２ 天 津 中医药大学 ， 天津 ３ ０ ９ ０ １３ 通讯作者 ： 张滕 ， ｍａ ：ａ．ｈｎｔｎ １３ ６ ．ｏ］ Ｅ ｉ ａａ ｚａｇ ｇ２ ＠１ ３ ｃｎ ｌ ｅ
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养是生物医学研究中常见的实验步骤。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 准备工具和试剂- 离心管、培养皿、组织研磨器、离心机、反应管等；- 消化酶（如胰蛋白酶、胰酶、胶原酶）、细胞分离缓冲液（如Hank's液、DMEM/F12液）- 磷酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、PBS缓冲液等。
2. 动物安乐死和心脏取出- 通过适当的麻醉方法将大鼠处死；- 固定大鼠，将心脏迅速取出。
3. 大鼠心脏组织的处理- 将心脏放入含有预冷的磷酸盐缓冲液的离心管中；- 用螺旋式切割器将心脏切碎并加入含有消化酶的组织研磨器中；- 用搅拌器均匀搅拌、体外消化。
4. 细胞的分离和纯化- 将组织胶块转移到筛网上，用PBS缓冲液冲洗细胞；- 收集细胞上清液，离心沉淀；- 用细胞分离缓冲液重新悬浮沉淀细胞。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 大鼠心肌细胞鉴定试剂- 法斯琪染色试剂；- cTnI、cTnT等心肌特异标志物抗体；- 免疫荧光显微镜。
2. 法斯琪染色鉴定- 采用法斯琪染色方案对心肌细胞进行染色；- 使用显微镜观察是否出现蓝色染色反应，标志细胞为心肌细胞。
3. 免疫荧光鉴定- 使用抗体与心肌特异标志物结合；- 使用免疫荧光显微镜观察细胞是否出现荧光信号。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 大鼠心肌细胞的培养基- 常用的培养基有DMEM/F12液、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）等。
2. 细胞培养条件- 培养基中添加适当的血清（如胎儿牛血清）和抗生素；- 培养箱中保持37℃、5% CO2含量。
3. 大鼠心肌细胞培养步骤- 将分离得到的心肌细胞加入培养基中；- 在培养箱中培养细胞，定期更换培养基；- 进行细胞观察和实验。
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养及荧光鉴定
岩， 张建华 ， 赵
勇
采用单纯胰蛋 白酶消化法分离 ， 差速贴壁法 纯化新生
液 等 自行 配置 。
大 鼠心肌细胞 。光学显微镜观察心肌细胞基本形态特征 ， 台
１ ． １ ． ３ 实验仪器 Ｚ Ｈ Ｊ Ｈ ． Ｃ １ １ １ ２ Ｂ超净工作 台（ 上 海智城公 司） ； Ｓ Ｍ Ａ Ｒ Ｔ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｃ Ｏ 培养箱 （ Ｈ ｅ ａ ｌ Ｆ ｏ ｒ ｃ ｅ
色法检测细胞成活率 达 ９ ０ ％ 以上 ； 肌钙蛋 白 Ｉ及 一 横 纹肌
肌动蛋 白免疫荧光染色法鉴定心肌细胞纯度达 ９ ８ ％ 以上 。
离心管 、 吸管 、 眼科剪 、 眼科镊等由本实验室提供 。
１ ． ２ 实验方 法
关键词
心肌细胞 ； 原 代培养 ； 新生大 鼠； 免疫 荧光
Ｒ ５ ４ ０ ． ４ ９
中图分类号
１ ． ２ ． １ 组 织 消化 和 细胞 分 离 配制 ０ ． １ ％胰酶 Ｄ －
文献标志码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ １ ４ ） ０ １— ０ １ ２ ０— ０ ３
Ｈ ａ ｎ ｋ 缓冲液 ， 过滤除菌备用 ； 恒温磁力搅拌器预热
至３ ５～３ ７℃ 、 转速 ８ ０—１ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ ； 取 出 生 １— ３日
・
１ ２ ０・
安徽 医科大学 学报
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ４ Ｊ ａ ｎ ； ４ ９ （ １ ）
新生 Ｓ Ｄ大 鼠心肌细胞 的原代培养及荧 光鉴定
姬婷婷 ， 徐
１ ． １ ． １ 实验动 物
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，可以用于研究心肌细胞的生理和病理过程。
下面将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养的步骤和注意事项。
一、心肌细胞的分离鉴定：1. 材料准备：- 大鼠心脏- 胰蛋白酶- 培养基（如DMEM/F12）- FBS（胎牛血清）- 抗生素（如青霉素/链霉素）- 生长因子（如胰岛素、培养基因素等）2. 心肌细胞的分离：- 用冰盐水冲洗大鼠心脏，将心脏置于0.1%胰蛋白酶溶液中，37℃恒温水浴放置15-20分钟。
- 取出心脏，去除杂质，用小孔濾网过滤，收集滤液。
- 加入预先冷却的培养基，离心分离细胞。
- 以适当的浓度重新悬浮心肌细胞。
3. 心肌细胞的鉴定：- 用显微镜观察细胞形态，心肌细胞的特点是形状呈纺锤形，具有交叉纹理。
- 心肌细胞可以用荧光染色的方法标记心肌肌纤维，如使用α-肌动蛋白标记。
- 用特异性抗体进行免疫染色，如心肌细胞特异性标志物肌球蛋白T (cTnT)。
2. 培养心肌细胞：- 将分离得到的心肌细胞在含10% FBS培养基的培养皿中培养。
- 培养皿放置于37℃恒温培养箱中，维持5% CO2的湿润环境。
- 每2-3天更换一次培养基，并观察细胞生长情况。
3. 细胞的凋亡和增殖：- 可以通过荧光染色，如使用Dapi染色观察细胞核形态来检测细胞凋亡。
- 可以使用CCK-8法或MTT法来测定细胞增殖情况。
4. 细胞的存活和形态观察：- 可以使用乙酰胆碱酯酶染色来观察细胞存活情况。
- 使用显微镜观察细胞形态的变化和生长状态。
总结：大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养是一项重要的实验技术，在心脏病等相关研究中有着广泛的应用。
通过使用适当的培养基和条件，合理观察和分析细胞的形态和生理活性指标，可以用于研究心肌细胞的生理功能和分子机制，为心脏疾病的治疗提供基础和参考。
新生大鼠心肌细胞培养技巧
新生大鼠心肌细胞培养技巧原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下：1新生大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.2消化酶的选择及使用新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g・L1,我们使用的为0.8 g・L1.胶原酶最好现用现配.3消化程度的把握新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意:(1)转速一般控制在60~80 r・min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化.4接种的细胞密度心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个.5细胞的分散度与接种的均匀性分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染.6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞.7换液时间进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ・L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响.8抗污染措施除应注意无菌操作等常规技术方法外，还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道.比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会.(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染.(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率.9培养液pH值适宜的pH范围在7.2~7.4之间，配制及使用培养液时应注意：(1) pH值会在过滤后上升0.1~0.3.(2)培养液中加入血清后pH值会有降低，降低程度与血清品质和含量有关.(3)应及时换液.(4)配制好的培养液不宜长时间贮存在4℃.这是因为培养液中的CO2会溢出，使培养液pH上升.每次配好的培养液尽量在2 wk内用完，否则应部分置于－20℃保存，使用前应补充谷氨酰胺和NaHCO3，再次过滤后方可使用.1，取心脏：起初取心脏的听说可以“剪开胸骨，就可以挤出来”但是找不到合适的剪开点。
新生大鼠心肌细胞的分离和培养
第33卷 第6期西北农林科技大学学报(自然科学版)V o l.33N o.6 2005年6月Jour.of N o rthw est Sci2T ech U niv.of A gri.and Fo r.(N at.Sci.Ed.)June2005新生大鼠心肌细胞的分离和培养Ξ刘 霞1,2,王常勇3(1西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;2延安大学生命科学学院,陕西延安716000;3军事医学科学院组织工程研究中心,北京100850) [摘 要] 为获得高纯度和高存活率的心肌细胞,探索心肌细胞大量培养的条件,并为进一步研究心肌细胞的细胞生物学特性奠定基础,同时为生理学和药理学研究提供细胞来源,试验采用胰蛋白酶顺序消化法及差速贴壁法,从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,观测心肌细胞的形态、结构、搏动状态和反映心肌细胞代谢状况的生化参数。
结果表明,分离所得的心肌细胞纯度高,培养第3天就开始自发搏动,后连接成片,进而同步收缩;心肌细胞的亚显微结构包括肌丝、Z线、线粒体和大量糖原颗粒,葡萄糖比消耗率为7.44nmo l (个・d),乳酸比产率为3.83nmo l (个・d),乳酸转化率为51%,细胞代谢非常旺盛,说明试验培养条件有利于心肌细胞的气体交换和营养物质的摄取,从而有利于心肌细胞的生长。
[关键词] 心肌细胞;细胞分离;细胞培养;大鼠[中图分类号] Q813.1+1;R318.11 [文献标识码] A[文章编号] 167129387(2005)0620035205 哺乳动物心脏由多种类型的细胞组成,近75%的细胞是非心肌细胞,如成纤维细胞和血红细胞等,心肌细胞占其余心脏细胞的25%,因此心肌细胞体外培养时极易被成纤维细胞污染,并可能影响到心肌细胞的分化[1]。
此外,新生大鼠心肌细胞体外培养时只能利用原代培养物,而心肌细胞的分离易受处理条件及培养技术水平的影响[2],且心肌细胞培养物的伸缩性和细胞间的接触有关,所以形成一个融合成片的单层心肌培养物极其困难。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是心脏组织中最主要的细胞类型，其具有重要的研究价值和应用前景。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法和技巧，以供需要的研究者参考。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 质子化心肌细胞将雄性大鼠（体重200-250g）置于无菌条件下，去毛、消毒，然后迅速取出心脏，置于含有生理盐水的培养皿中。
使用显微镊子和显微刀将心脏分割成小块，使得心肌组织充分暴露。
将小块心肌组织转移至含有0.05%的胰酶和0.1%的胰蛋白酶的新鲜培养液中，温育30分钟至1小时。
温育完成后，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基冲洗心肌组织，过滤去除残留的纤维和细胞碎片。
对心肌组织进行胶原酶-胰蛋白酶消化，离心沉淀后获取心肌细胞。
2. 分离和纯化获得的心肌细胞需要经过一定的分离和纯化步骤，以消除其他非心肌细胞的干扰。
常用的分离方法包括稳定梯度离心法、摇床培养法和免疫分选法。
通过适当的分离方法，可以获得较为纯净的大鼠心肌细胞用于后续研究。
1. 形态学鉴定通过显微镜观察大鼠心肌细胞的形态结构，包括细胞形状、大小、核与细胞浆的比例等，进行初步的鉴定。
正常的心肌细胞呈长条状，具有跨膜结构，胞质内含有丰富的线粒体和肌纤维等特征。
2. 免疫细胞化学鉴定通过特异性抗体对心肌细胞进行染色和标记，观察其对特定标记蛋白的表达情况。
常用的标记蛋白包括肌动蛋白、肌球蛋白、心肌肌球蛋白等。
通过免疫细胞化学鉴定，可以明确心肌细胞的特异性。
1. 培养基的选择大鼠心肌细胞的培养通常选用DMEM（Dulbecco's modified eagle's medium）培养基，添加10%的胎牛血清和适量的抗生素。
培养基的pH值应调整在7.2-7.4之间，以及含有必要的营养物质和生长因子。
2. 细胞密度和培养条件将鉴定过的心肌细胞悬浮于培养基中，调整成合适的细胞密度后，接种于预先涂覆明胶质或明胶胱聚糖混合物的培养皿中。
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法
新生大鼠心肌细胞原代培养实验具体步骤及方法将大鼠的心肌细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
一、实验材料准备1. 动物出生后1-4 天SD 乳鼠15 只。
2. 试剂低糖DMEM、胰酶(含EDTA)、青链霉素、碳酸氢钠液、新生牛血清、谷氨酰胺、D-Hank's 液。
0.1%新洁尔灭、碘酒、75%酒精，培养液(DMEM，新生牛血清，青链霉素)。
3. 手术器械和仪器铝盒、眼科直剪、眼科弯剪、眼科直镊、眼科弯剪、玻璃培养皿(共2 套，一套用于解剖取材，另一套用于剪碎心脏组织)、100 ml 广口瓶两个(分别装碘酒和酒精棉球)、500 ml 烧杯、250 ml 锥形瓶、15 ml和50 ml 的离心管，磁力搅拌器和搅拌子(或者水浴振荡器)、150-200 目尼龙筛网和针式滤器。
二、方法1. 将胰酶用D-Hank's 液配成0.06%的浓度，并放置于37℃水浴中温育好。
2. 解剖取材：将乳鼠放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出，用另一把大镊子取碘酒棉球擦皮肤，再用酒精棉球脱碘。
左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手取一把眼科直剪剪开皮，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒后，取一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。
这样只要左手稍顶，乳鼠的心脏就直接跳出来。
然后用眼科弯镊从心脏中部直接将心室部分剪下，放入冰浴的D-Hank's 液中。
重复以上过程。
取材完毕后，撤掉取材的手术器械。
注：为了保证心肌细胞的活力，取心的操作过程尽量快，另外，最好把盛的心脏的培养皿放置在冰台上或者预冷的平衡盐液中。
3. 用第二套手术器械进行下列操作。
用眼科直镊和眼科弯剪把培养皿中的心脏周边的血凝块及纤维组织剔除掉，放在另一个预先装好D-Hank's液的培养皿中，把心脏组织再洗一遍后，将心脏组织放在另外一个培养皿中(或者其它合适容器中，视个人习惯)，加少许0.06%胰酶，用眼科弯剪将心脏组织剪成1mm3大小的碎块，将剪碎的心脏和胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，另外吸取2-3 ml新鲜的胰酶冲洗平皿和剪刀并转入锥形瓶中，补加胰酶至终体积10 ml，加上塞子，放在37℃水浴中(可以用一个消毒的500 ml烧杯，装好无菌的蒸馏水，加够水量，水位线稍低于250 ml锥形瓶的刻度线即可，过少则温度会不均匀，过高容易污染。
新生SD大鼠心肌细胞原代培养方法改进
* " 重大新药创制" 科技重大专项十二五课题。课题名称为： 毒性生物标志物与人源化动物模型关键技术研究。课题号： 2012ZX09505001 － 001
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中药药理与临床 2012； 28（ 6）
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实验方法
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新生 SD 大鼠心肌细胞原代培养方法改进*
郭 舜，张树江，段 蕊，张金晓，田义红＊＊，申秀萍 （ 天津市新药安全评价研究中心，天津 300301）
摘 要 目的：改良心肌细胞原代培养的方法条件、培养纯度，提高心肌细胞收获率和存活率。方法：取出生 24h 内 SD 大鼠
1 材料与方法
1． 1 动物 选择出生 24h 之内的 SD 大鼠，雌雄不拘，购自北 京维通利华实验动物技术有限公司。 1． 2 试 剂 0． 05% 胰 蛋 白 酶 和 Ⅱ 型 胶 原 酶 （ Gibco 公 司） ； DMEM-F12 培养基 （ Gibco 公司； DPBS（ Gibco 公司） ； 新生牛血 清（ Gibco 公司） ； 5-溴脱氧尿嘧啶（ Brdu） （ Sigma 公司） ； α-横纹 肌肌动蛋白（ α-sarcomericactin，α-SA） 单抗（ Abcam 公司） ； 二抗 （ Millipore IHC Select） 。 1． 3 仪器 倒置成像显微镜（ NIKON eclipse TS100-F） ； 二氧化 碳培养箱（ 三洋 MCO-19AIC） ； 高速台式离心机（ Thermo Scientific Sorvall ST16） ； DKB-501 型超级恒温水浴槽（ 上海森信实验仪 器有限公司） 。 1． 4 培养方法 取 24h 出生之内的 SD 大鼠（ 10 ～ 15 只） ，75% 酒精消毒。迅速开胸取出跳动心脏，放入预冷的含 1% 青链霉 素的 DPBS 中，反复冲洗 3 遍，洗去残留的血细胞。用弯头眼科 镊取心尖（ 心室） 部，至于预冷的 1% 青链霉素的 DPBS 中进行 漂洗 3 遍。更换眼科剪将漂洗后的心尖剪成约 0． 5 ～ 1mm3 的 小块，加入约 3 倍体积的 0． 05% 的胰蛋白酶消化，轻轻吹打后 弃去第一次的消化液，以去除血细胞。将剩余组织中加入 0． 1% 的Ⅱ型胶原酶溶液 5ml 转移至 50ml 无菌离心管中，于 37℃
新生SD大鼠心肌细胞的原代培养
３（ １ １ ）： ９ ６ ４—９ ６ ６ ．
作者简介 ： 张彤 ， 女， 副主任医师， 现工 作 于 山东 中医 药 大 学 附 属 医 院 （ 邮
编： ２ ５ ０ ０ １ １ ） ； 刘元峰 、 宋宪波， 工 作 于 山 东 中医 药 大 学 ； 苏文革 、 吴波 、 戴 国华（ 通 讯作 者 ） ， 工 作 于 山 东 中 医 药 大学 附属 医 院 （ 邮编 ： ２ ５ ０ ０ １ １ ） 。 （ 收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３—０ ４ —０ ３ ） （ 本 文 编辑 王 雅 洁 ）
［ ３ ］ Ｂ ｕ ｒ ａ ｓ ｈ ｎ ｉ ｋ ｏ ｖ Ａ， Ａｎ ｔ ｚ ｅ ｌ ｅ ｖ ｉ ｔ ｃ ｈ Ｃ ． Ｂ ｌ ｏ ｃ ｋ ｏ ｆ Ｉ （ Ｋｓ ）ｄ ｏ ｅ ｓ ｎ ｏ ｔ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ
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ｖ ａ ｓ ｃ Ｅｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈｙ ｓ ｉ ｏ １ ． ２ ０ ０ ０， １ １ （ ４） ： ４ ５ ８—４ ６ ５ ．
平， 达 到 修 复 内皮 功 能 的 目的 ， 提 示 其 在 治 疗 心 肌 梗 死 等 严 重 缺 血 性 疾 病 中有 着 较 好 的应 用 前 景 ， 但其促进 Ｅ Ｐ Ｃ归 巢 到 心 肌 的
关键 词 ： 心肌细胞 ； 原代 培 养 ； 心肌细胞鉴定 ； Ａｃ ｔ ｉ ｎ免 疫 组 化
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是心脏的主要细胞类型，负责心脏机械和电生理活动，对心脏健康具有重要的影响。
因此，研究心肌细胞具有重要的应用价值。
在本文中，将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养技术。
1.1 心肌细胞的分离将大鼠心脏取出，用注射器将缓冲液（如PBS）注入主动脉，以清洗心脏内部的血液。
随后，将心脏移至一盛装有酶消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，肌肉组织被消化成单个细胞。
消化时间一般为20-30分钟，消化程度可以调整。
之后用培养液（如DMEM/F12）中和胰蛋白酶的酶消化液，使消化过程终止。
细胞分离后可以使用显微镜进行观察，同时也可以通过显微镜观察细胞形态来判断分离效果。
大鼠心肌细胞通常采用肌钙蛋白T的免疫荧光染色进行鉴定。
此外还可以使用心肌特异性的基因表达来鉴定心肌细胞。
通过PCR扩增，可以检测到只存在于心肌细胞中的基因，如心肌肌钙蛋白T和肌红蛋白等。
在培养前，需要先将心肌细胞分离、鉴定和计数。
以下是大鼠心肌细胞的培养方法：2.1 培养基适用于大鼠心肌细胞的培养基包括：DMEM/F12、M199、MEM、RPMI 1640等培养基，其中DMEM/F12和M199为常用培养基。
大鼠心肌细胞通常以静态培养为主，营养液一般为12%胎牛血清、5%马血清混合的DMEM/F12培养基。
细胞应在涂有胶原质的培养皿中培养。
培养室温度为37℃，5% CO₂的有利条件下培养。
此外，需要注意的是，心肌细胞对缺氧和低氧非常敏感，因此在培养过程中应始终维持培养皿内的氧气浓度。
通常情况下，大鼠心肌细胞的培养状态可以分为初代培养和传代培养。
初代培养的心肌细胞生长很快，但失去了心肌特异性表达，而传代培养中将保留心肌特异性的表达。
在传代培养时，需要定期检测细胞数量，并在细胞繁殖至80-90%时进行传代。
此外，传代时应注意保持培养基的组成和浓度的稳定，避免对细胞造成损伤。
总之，大鼠心肌细胞的分离鉴定和培养对于心血管疾病研究具有非常重要的意义。
大鼠原代心肌细胞分离
分离大鼠原代心肌细胞概述：整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，大鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
大鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
材料：1、培养液：1：1 混合的DMEM / F12 培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05% ，用pH 7.2-7.8 的D-Hanks溶液配制，-20 ℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH 7.2-7.8）：KCl 0.4 g 、KH2PO4 0.06 g 、NaCl 8.00g 、NaHCO3 0.35 g 、Na 2HPO4•7H2O 0.09 g 、酚红0.01 g 1L。
方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。
2、用D-Hanks溶液（过滤灭菌）配制0.1%胰酶15 mL备用（胰酶原液0.25%）。
3、新生（2-3天）vistar乳大鼠20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。
4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放D-Hanks 溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。
另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放D-Hanks溶液，其二放1mL0.1%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。
5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。
6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有D-Hanks溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。
原代心肌细胞分离 实验(体验版)
原代心肌细胞分离1 材料与方法1.1实验动物选择出生0.5-1天的清洁级SD新生大鼠，雌雄不限1.2主要的实验仪器CO2恒温培养箱；倒置显微镜；Nikon-E440荧光显微镜胰酶；Ⅱ型胶原酶；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）；肌球蛋白重链蛋白（MF-20）单克隆抗体（武汉博士德公司）;Hoechest；无钙镁磷酸盐缓溶液；胎牛血清（FBS）；氯霉素+新链霉素溶液I 15ml（DMEM-F12 13.5ml，FBS1.5ml，氯霉素+新链霉素150ul）溶液II 30ml（DMEM-F12 25.5ml，FBS4.5ml，氯霉素+新链霉素300ul,BrdU 100ul 10mg/ml）新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶（0.01g粉末+ 10ml PBS 0.2um过滤器过滤）1.3大鼠心肌细胞分离和培养于超净工作台中，取新生1-2天SD大鼠10只，75%酒精溶液浸泡3-5s杀菌消毒。
更换器械于无菌条件下立即打开胸腔,准确取出心脏,放于预冷的无钙镁磷酸盐缓溶液中漂洗5次，并依次去除心脏周围及心脏房室腔内的血液或血凝块，剪去心房部分，获取心尖心室部分，迅速转移至200ul预冷的0.1%胰酶的无钙镁磷酸盐缓液中，将心肌组织反复剪成约0.5-1 mm3的组织块，将剪碎的组织块混合液转移到50ml的离心管中静置于冰箱4℃消化过夜（每隔段时间摇晃一下）。
第二日，配置新鲜的0.1%Ⅱ型胶原酶10ml（0.2um过滤器过滤），置换等量心脏消化液，于磁力搅拌器上温和搅拌消化30min，温度34℃，转速100-120g。
待消化液中组织块全部消化完时，加入10ml溶液I终止消化，1500rpm离心10min,小心弃去上清，加入5ml溶液I，1500rpm离心5min，小心弃去上清，加入溶液II 10ml(含0.1 mmol/L BrdU，以抑制成纤维细胞的增殖)，轻轻吸打混匀后400目细胞筛过筛入10cm大皿中，置于体积分数为5%的CO2培养箱中，差速贴壁培养2h。
新生大鼠原代心肌细胞分离
新生大鼠原代心肌细胞分离实验用材料a) Fibronectin: Sigma; Catalog # 2891492b) Phosphate-Buffered Saline (PBS) Ca/Mg free: HyClone; Catalog #c). Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS, D-Hanks’),d) Trypsin: Gibco; Catalog # 27250-018（28mg）e) Collagenase Type I I: Gibco; Catalog # 17101-015（20mg）f) DMEM: Hyclone; Catalog # SH30022.08g) Fetal Bovine Serum (FBS): Gibco; Catalog # 16000-044原代新生乳鼠心肌细胞分离一、FN包被Cardio Plate（时间：约3小时）1．使用PBS缓冲液将1mg/ml的FN储存液按1：100的比例稀释成1ug/ml工作液2．在E-Plate Cardio 96每孔加入20—30 µl 配制好的1ug/ml的FN工作液。
3．将包被好的E-Plate Cardio 96 置于细胞培养箱内约3h左右。
二、原代大鼠心肌细胞分离（时间：约3小时）1. 获取大鼠心室组织(使用出生24h内的SD大鼠)。
1) 用70%的酒精消毒乳鼠。
2)无菌的解剖板上，左手用镊子固定乳鼠，右手持眼科剪，在无菌条件下迅速剪开胸骨剑突下稍左侧的皮肤。
换眼科剪，在胸骨剑突下稍左侧打开胸腔，左手轻轻用力，心脏跃出，用眼科弯镊取心脏心尖部，置于预冷的DMEM中，在预冷的DMEM 中漂洗3次，去除血液。
3) 将漂洗后的心尖组织在预冷的DMEM去除心房和血管等组织。
4) 在5ml玻璃瓶中加入2ml预冷的HBSS，将心尖转移到HBSS中，用眼科剪剪成约1mm3的小块。
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原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养
1.动物与仪器
1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。
1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。
2.方法
2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。
2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。
2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。
随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。
细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。
2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。
细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％.
2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。
随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。
阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
【参考文献】
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