分子基本操作技术
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5
1、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的 分离纯化和鉴定核酸的方法 • 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 • 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和 低熔点琼脂糖
• 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃ 下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段 的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等
26
4）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂 、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
28
5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下 降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
4
DNA加样孔 阴极 阳极
大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA 移动的快
电泳缓冲液
在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子 化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子 （polyanions），把这些核酸分子放臵在电场当中，它们就会向正 电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度 向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移 速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这 就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。
简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等 组织的粗提DNA
22
（四）PCR反应体系
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 (上、下游引物) 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双蒸水至 100ul
第一节 凝胶电泳技术
• 一、常规电泳
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 二、脉冲凝胶电泳
3
一、常规电泳
• 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小 分离 DNA 的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组 DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许 多分子生物学研究方法，如： DNA 分型、 DNA 核苷酸序列分析、 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学 界的高度重视。 • 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放 臵到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用 下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比， 与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度 的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过 电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。
16
PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链 后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 17 对结合；
14
PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 ，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 ；
–天然酶：从嗜热水生杆菌中提纯 –基因工程酶：大肠菌合成
• 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反 应体积为100 ul时） • 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少
25
3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低 则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降 ，影响DNA聚合酶的活性。
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一
个循环需2 ～4分钟， 2～3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。
19
（三）PCR反应
标准的PCR反应条件：
10X缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 10 μL 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2μg 2.5U 1.5mmol/L
在紫外线的照射下结合溴化乙锭的 DNA分子发出荧光
10
第三节 聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链式反应，即 PCR 技术，是一种在体外快速扩 增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量 的目的基因或某一特定的 DNA片段扩增数十万乃至千 百万倍。
• 一、PCR技术原理 • 二、PCR技术主要类型 • 三、PCR技术主要应用
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
21
PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位） 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
8
4）载样缓冲液
• 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成载样缓冲液 • 作用：
–①增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 –②在电泳中形成肉眼可见的指示带， 可预测核酸电泳的速度和位臵 –③使样品呈色，使加样操作更方便
9
在凝胶电泳中，加入适 量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染 料对核酸分子进行染色 ，然后将电泳标本放臵 在紫外光下观察，可十 分灵敏而快捷地检测出 凝胶介质中DNA的谱带 部位，即使每条DNA带 中仅含有0.05μg的微量 DNA，也可以被清晰地 检测出来。
29
2、循环参数
(1) 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增Baidu Nhomakorabea温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。
30
（3）延伸
70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 链。 18
从 20 世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作 和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括 DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分 子生物学研究的核心技术。
• 基因组 DNA 提取技术 • 凝胶电泳技术
23
1、PCR反应五要素（反应成分）
1) 引物（primers）
2) 酶 （Taq DNA polymerase）
3) dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
4) 模板 （template）
5) Mg2+ （magnesium）
24
2）酶及其浓度
• 目前有两种Taq DNA聚合酶供应
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
31
三、PCR技术应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
32
• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
20
PCR反应
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2 条变 单性 链
55 22
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
12
一、PCR技术原理
13
（二）PCR的基本原理
• 类似于DNA的体内复制。首先将待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合 物冷却至某一温度，这一温度可使引物与 它的靶序列发生退火，再将温度升高使退 火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。•这 种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循 环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不 断重复。
7
2）电泳缓冲液
• 常用三种缓冲液
–Tris-硼酸（TBE） –Tris-乙酸（TAE） –Tris-磷酸（TPE）
• TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果 好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓 度高，容易使DNA沉淀 • TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲 液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑 制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解
6
1）凝胶浓度选择
琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围
凝胶的分辨能力 同凝胶的类型和浓 度有关，凝胶浓度 的高低影响凝胶介 质孔隙的大小，浓 度越高，孔隙越小 ，其分辨能力就越 强。反之，浓度降 低，孔隙就增大， 其分辨能力也就随 之减弱。 琼脂糖浓 线型DNA分子的分 度(%) 离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2
1、琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的 分离纯化和鉴定核酸的方法 • 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 • 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和 低熔点琼脂糖
• 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃ 下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段 的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等
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4）模板
单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂 、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
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5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下 降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
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DNA加样孔 阴极 阳极
大分子量的DNA 移动的慢
小分子量的DNA 移动的快
电泳缓冲液
在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子 化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子 （polyanions），把这些核酸分子放臵在电场当中，它们就会向正 电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数 量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度 向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移 速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这 就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。
简便、快速
1. 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2. 扩增产物一般用电泳分析
对标本的纯度要求低
血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等 组织的粗提DNA
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（四）PCR反应体系
标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 (上、下游引物) 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双蒸水至 100ul
第一节 凝胶电泳技术
• 一、常规电泳
琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 二、脉冲凝胶电泳
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一、常规电泳
• 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小 分离 DNA 的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组 DNA 分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许 多分子生物学研究方法，如： DNA 分型、 DNA 核苷酸序列分析、 限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学 界的高度重视。 • 基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放 臵到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用 下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比， 与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度 的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过 电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。
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PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链 后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 17 对结合；
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PCR原理示意图
PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)
Target Sequence
Target Sequence
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 ，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 ；
–天然酶：从嗜热水生杆菌中提纯 –基因工程酶：大肠菌合成
• 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反 应体积为100 ul时） • 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则 合成产物量减少
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3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低 则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降 ，影响DNA聚合酶的活性。
End of the 1st PCR Cycle –
Results in two copies of target sequence
每完成一
个循环需2 ～4分钟， 2～3小时 就能将待 扩目的基 因扩增放 大几百万 倍。
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（三）PCR反应
标准的PCR反应条件：
10X缓冲液 4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 10 μL 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2μg 2.5U 1.5mmol/L
在紫外线的照射下结合溴化乙锭的 DNA分子发出荧光
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第三节 聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链式反应，即 PCR 技术，是一种在体外快速扩 增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量 的目的基因或某一特定的 DNA片段扩增数十万乃至千 百万倍。
• 一、PCR技术原理 • 二、PCR技术主要类型 • 三、PCR技术主要应用
DNA双螺旋
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时间（min）
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PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
灵敏度高
1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平
2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位） 4. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
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4）载样缓冲液
• 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成载样缓冲液 • 作用：
–①增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 –②在电泳中形成肉眼可见的指示带， 可预测核酸电泳的速度和位臵 –③使样品呈色，使加样操作更方便
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在凝胶电泳中，加入适 量溴化乙锭（ethidium bromide，简称EtBr）染 料对核酸分子进行染色 ，然后将电泳标本放臵 在紫外光下观察，可十 分灵敏而快捷地检测出 凝胶介质中DNA的谱带 部位，即使每条DNA带 中仅含有0.05μg的微量 DNA，也可以被清晰地 检测出来。
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2、循环参数
(1) 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒
(2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增Baidu Nhomakorabea温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。
30
（3）延伸
70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次
PCR Cycle - Step 3 -
At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated
③引物的延伸： DNA模板--引物 结合物在 TaqDNA聚合酶 的作用下，以 dNTP为反应原 料，靶序列为模 板，按碱基配对 与半保留复制原 理，合成一条新 的与模板DNA 链。 18
从 20 世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速 发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作 和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括 DNA分子的切割与连接、核 酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析 以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分 子生物学研究的核心技术。
• 基因组 DNA 提取技术 • 凝胶电泳技术
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1、PCR反应五要素（反应成分）
1) 引物（primers）
2) 酶 （Taq DNA polymerase）
3) dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
4) 模板 （template）
5) Mg2+ （magnesium）
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2）酶及其浓度
• 目前有两种Taq DNA聚合酶供应
次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
31
三、PCR技术应用
• 研究
– 基因克隆，DNA测序，分析突变 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 – 犯罪现场标本分析 – 各种肿瘤检测
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• 诊断
• 人类基因组工程
• 法医
• 肿瘤
• 其他……
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
20
PCR反应
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
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重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2 条变 单性 链
55 22
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
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一、PCR技术原理
13
（二）PCR的基本原理
• 类似于DNA的体内复制。首先将待扩增 DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合 物冷却至某一温度，这一温度可使引物与 它的靶序列发生退火，再将温度升高使退 火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。•这 种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循 环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不 断重复。
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2）电泳缓冲液
• 常用三种缓冲液
–Tris-硼酸（TBE） –Tris-乙酸（TAE） –Tris-磷酸（TPE）
• TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果 好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓 度高，容易使DNA沉淀 • TAE：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲 液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑 制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解
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1）凝胶浓度选择
琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围
凝胶的分辨能力 同凝胶的类型和浓 度有关，凝胶浓度 的高低影响凝胶介 质孔隙的大小，浓 度越高，孔隙越小 ，其分辨能力就越 强。反之，浓度降 低，孔隙就增大， 其分辨能力也就随 之减弱。 琼脂糖浓 线型DNA分子的分 度(%) 离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2