包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程
ELISA实验步骤
操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。
2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。
同时作稀释液对照。
37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液：每孔50微升。
11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA试剂及操作步骤
操作方法1、包被：用包被液CBS稀释包被抗原至菌含量为2×108cfu，酶标板中每孔加入50μl，湿盒内室温或4℃或37℃过夜包被。
2、洗涤：弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。
3、封闭：每孔加封闭液（1%BSA）250μl，（10ml 5%。
0.5g）37℃封闭2h。
4、洗涤：用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。
5、结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔50μl，要设立阴性对照，37℃孵育1.5h。
6、洗涤：同上。
7、结合二抗：每孔加用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP（稀释倍数根据产品不同有所不同，可按说明书进行）50μl，37℃孵育1.5h。
8、洗涤：同上。
9、显色：每孔加底物溶液（OPD）50μl (配10ml) ，置室温暗盒内显色10min。
10、待显色后，每孔加入50μl终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。
使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平。
ELISA 检测所用主要试剂：包被缓冲液：0.05mol/L ，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS ）Na 2CO 3 l.59gNaHCO 3 2.93g加去离子水水至1000ml ，调pH 值到9.6。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
磷酸盐缓冲溶液（1×PBS ）：0.01 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO4 0.2gKCl 0.2gNa 2HPO 4·12H 2O 2.9g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
10×PBS ：0.2 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO 4 2.4gKCl 2.0gNa 2HPO 4·12H 2O 36.05g 或Na 2HPO 4 14.4g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
ELISA步骤及注意事项
1.蛋白包板：选择合适的蛋白包被浓度梯度，计算上样体积并用包被液稀释（50 μl/孔）。
2. 4 ℃过夜或者37 ℃孵育2 h。
3.用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
4.封闭：（1）新配1～2% BSA或5% 脱脂奶粉（都用PBS配制）（2）上样量100μl/孔（3）37 ℃孵育1～2 h（4）作用：封闭未被蛋白结合上的位点，防止待测抗体与板上空白位点的结合，减少非特异性反应。
5．用PBST洗涤2～3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
6. 封闭期间完成一抗的浓度梯度选择和稀释:（1）用新配1% BSA 对一抗进行稀释（BSA可以中和一抗中可能存在的抗BSA的抗体，降低非特异性反应），计算所需稀释液体积后配制。
（2）上样量50μl/孔（3）空白对照和阴性对照孔加等体积PBS（4）37 ℃孵育1 h7．用PBST洗涤3次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
8. 一抗孵育期间配制酶标二抗稀释液（1）用新配1% BSA进行稀释，计算所需稀释液体积后配制（一般1:5000）（2）上样量50μl/孔（3）阴性对照孔也加等体积二抗稀释液（4）37 ℃孵育45min～1 h(同一批次二抗孵育时间必须固定，如1h)9. 用PBST洗涤3～4次，250 μl/孔，每洗一次，倾倒洗液并于干净吸水纸上拍板。
10.显色：（1）A液和B液等体积混合，在使用前需在室温下放置30 min。
（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（A：B= 5ml: 5ml）（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积显色液（4）显色液上样速度一定要快速并保持匀速（5）37 ℃孵育10 min或者室温避光15 min(从加完第一块板即开始计时)11.终止：（1）2M H2SO4作为终止液（2）上样量100μl/孔，计算用量：96孔×100 μl/孔= 10 ml/板（3）空白对照孔和阴性对照孔也加等体积终止液（4）终止液上样速度一定要快速并保持匀速12.读数，分析数据于酶标仪测得各孔OD值（终止后10min内），分析处理数据(一)注意事项1.加样在ELISA中除了包被外，一般需进行4－5次加样。
ELISA法检测步骤
ELISA法检测步骤及其结果一、实验材料96微孔板包被抗原：原核表达纯化的CD147 （原始浓度0.5mg/ml PBS）二抗：羊抗人-HRP二、溶液配制①0.01M PBS ：PH 7.2 –7.4(Na2HPO4·12H20 3.73g + KH2PO4 0.43g + NaCl 7.2g ，加水至1000ml)②包被液：磷酸盐缓冲液(Na2CO3 1.59g + NaHCO3 2.93g ，加水至1000ml)PH 9.6，4℃保存③封闭液：5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉，加PBS至100ml，-20℃保存）④洗液：0.5‰PBST（1000ml PBS + 500ul Tween-20）⑤TMB显色系统：(现用现配)⑥终止液：2M H2SO4(21.7ml浓硫酸逐滴加入178.3ml水中)三、实验过程1．包被液稀释抗原至15ug/ml，每孔100ul，4℃过夜。
2．洗液清洗3min×3，拍干。
3．加入封闭液，每孔150ul，37℃，30min。
4．洗液清洗3min×3，拍干，直接使用（或-20℃储存备用）。
5．加培养上清，100 ul/孔。
6．洗液清洗3min×3，拍干。
7．加入羊抗人-HRP工作液，每孔100ul，37℃，40min。
8．洗液清洗3min×3，拍干。
9．加入显色液，每孔100ul。
10.加入终止液，每孔100ul。
11. ELISA读板仪上读取450nm处OD值。
1. Coated antigen was diluted to 15ug/ml, each hole 100ul,4 ℃ overnight.2. Cleansing lotion 3min × 3, shoot dry.3. Add closed fluid, each hole 150ul, 37 ℃, 30min.4. Cleansing lotion 3min × 3, shoot dry, direct use of (or-20 ℃ storage standby).5. Canadian culture supernatant, 100 ul / hole.6. Cleansing lotion 3min × 3, shoot dry.7. Add goat anti-mouse-HRP working solution, each hole 100ul,37 ℃, 40min.8. Cleansing lotion 3min × 3, shoot dry.9. Add color liquid, each hole 100ul.10. Add to terminate fluid, each hole 100ul.11. ELISA plate read meter reading OD values 450nm Department.。
包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程
包涵体蛋白包被ELISA 板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA 板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SK（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4°C过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的Buffer A溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SK啲Buffer A 溶解（使用前混合，1.97 ml Buffer A 加入0.03 ml 20 %的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS 4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20C冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMS瞻解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4C融化。
在ELISA板每孔加入100卩L CBS。
将100卩L抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100 g L加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100g L加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100 g L液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的Buffer A 做对照。
2、包被：4C过夜或37C温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST室温静置 5 分钟后弃去，反复三次）。
拍干！3、封闭：5%兑脂乳300 g L，37C温育2小时或4C过夜。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次，拍干！。
封闭不彻底会导致假阳性！4、稀释阳性血清：在本实验中，傅强的阳性血清和李仕超的阴性血清均做1000倍稀释。
elisa法检测步骤
elisa法检测步骤ELISA法，即酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用于检测特定抗原或抗体的方法。
它基于免疫学原理，通过特异性抗体与抗原结合并利用酶的催化作用产生可测定的信号，从而实现对目标物质的定量检测。
下面将介绍ELISA法的基本步骤以及注意事项。
1. 抗原或抗体的固定需要将待测抗原或抗体固定在固相载体上，常用的载体有微孔板等。
固定的目的是为了使待测物能够与特异性抗体或抗原结合，并保持其稳定性。
2. 阻断非特异性结合位点在固定的抗原或抗体上，加入一种阻断剂，如牛血清蛋白（BSA）或鱼胶蛋白（Gelatin），以防止非特异性结合。
3. 特异性抗体的结合将待测样品加入到固定的抗原上，使其中的抗原与特异性抗体发生结合反应。
特异性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其选择应根据具体实验需求。
4. 酶标记二抗的结合经过特异性抗体的结合后，再加入酶标记的二抗。
酶标记的二抗与特异性抗体的结合形成免疫复合物。
5. 酶底物的加入在免疫复合物形成后，加入酶底物。
酶底物与酶标记的二抗结合后，酶会催化底物的反应，产生可测定的信号。
常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
6. 反应停止根据酶底物的选择，选择合适的反应停止液，使酶催化反应停止。
常用的反应停止液有硫酸或碳酸氢钠。
7. 信号检测将停止反应后的溶液转移到酶标仪或光度计中，测定产生的信号强度。
ELISA法可以通过颜色反应或发光反应来进行信号检测。
ELISA法作为一种常用的检测方法，在临床诊断、生物医学研究和生物工业等领域都有广泛应用。
但在进行ELISA实验时，还需要注意以下几点：1. 严格控制实验条件，包括温度、时间和pH值等，以确保实验结果的准确性。
2. 选择合适的阳性和阴性对照，以验证实验的可靠性和敏感性。
3. 遵循操作规范，注意实验操作的无菌和无污染。
4. 合理选择稀释倍数，以保证实验结果在检测范围内。
elisa检测的基本流程
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ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immuno sorbn ent Assay)的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一) 原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELI SA间接法。
(二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测蛋白质或抗体的定性和定量方法。
它的基本原理是利用酶-抗体偶联物来检测特定目标物质的存在，通过酶催化底物的变化来实现信号的放大和检测。
下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及相关的材料和试剂。
1.涂板：首先，将微孔板（96孔板或其他规格的板）用目标蛋白质或抗体溶液涂覆在表面上，使其吸附固定。
这一步通常称为“涂板”。
2.阻断：将蛋白质或抗体涂覆后的微孔板用阻断剂（例如牛血清蛋白、BSA）进行阻断处理，以防止非特异性结合。
3.样品处理：将待检测的样品加入到微孔板中，并与目标蛋白质或抗体结合（如果存在）。
样品通常需要经过一系列稀释步骤，以便在量化检测时得出准确的结果。
4.洗涤：使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的物质。
5.二抗处理：加入与待检测物种类对应的二抗荧光素，使其与待检测物结合。
这一步通常称为“二级标记”。
6.洗涤：再次使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的二抗。
7.底物结合：加入底物（如TMB或ABTS）并等待一定的反应时间，使酶催化底物的变化产生可观察的颜色变化。
8.反应停止：加入停止液（如硫酸、盐酸）停止底物的反应。
9.测量：利用酶催化反应产生的颜色变化通过酶标仪或光谱仪进行测量，得出待测量物的浓度或定性。
1.微孔板：一般使用96孔的微孔板，也可根据需要选择其他规格的板。
2.涂板物质：目标蛋白质或抗体等。
3.阻断剂：常用的阻断剂有牛血清蛋白（BSA）等。
4.样品：待检测的生物样品，可以是血清、细胞提取物或其他组织液。
5.二抗：与待检测物种类对应的二抗，通常是抗体。
6.底物：用于酶催化反应并产生颜色变化的化学底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）、ABTS等。
7.停止液：停止底物的反应，如硫酸、盐酸等。
8. 缓冲液：用于洗涤和稀释的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（含Tween-20的洗涤缓冲液）等。
酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明
酶联免疫吸附（ELISA）实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附（ELISA）可以：（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
（2）研究抗酶抗体的合成。
（3）显现微量的免疫沉淀反应。
（4）定量检测体液中抗原或抗体成份。
本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。
因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。
我们用在霍乱肠毒素的测定。
HbSAg及HbS的测定。
具体步骤一、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃过夜，或37℃水浴3小时，贮存冰箱。
二、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
三、每凹孔加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37℃作用1～2小时。
四、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液，37℃作用1～2小时或由预试实验确定作用时间。
六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟。
七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔(OPD或OT)，室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）。
八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml。
九、观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm）OD值。
注意事项1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。
ELISA步骤、试剂及注意事项
ELISA步骤、试剂及注意事项操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法：1.包被：用0.05M PH9。
牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0。
1ml,4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。
（简称洗涤，下同)。
2.加样:加一定稀释的待检样品0。
1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤.（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3。
加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度)0。
1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0。
1ml,37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm （若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2。
1倍，即为阳性.方法二用于检测未知抗体的间接法:用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0。
1ml，4℃过夜.次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。
(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体）0。
1ml,37℃孵育30—60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
试剂器材1.试剂（1）包被缓冲液（PH9。
6 0。
05M碳酸盐缓冲液)：NaCO3？1.59克NaHCO32。
93克加蒸馏水至1000ml（2）洗涤缓冲液(PH7。
4 PBS）:0.15M KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8。
ELISA法检测肺炎衣原体(IgM)抗体测定(CP-IgM)标准操作程序
1.检测原理采用间接法原理检测人血清样品中肺炎衣原体（IgM）抗体（CP-IgM），包被抗原。
待测样本加入已包被抗原的反应孔内孵育，若标本中含有CP-IgM抗体，则该抗体与微孔内抗原形成抗原抗体复合物，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，经孵育后，酶标记物连接至抗原抗体复合物上，在TMB底物参与反应的情况下，产生显色反应。
2. 样本类型及处理3.试剂注意事项：开启所有试剂（包括校准品、标准品、质控品）需注明日期及签名。
每个试剂容器都需贴上写有以下内容的标签：启用日期、截止日期。
开启时应检查试剂是否变色，是否肉眼可见的细菌生长迹象、浊度、沉淀反应等，这些表示试剂已经变质或超过保质期。
4.仪器设备备注：“溯源方式”栏填写送较、自校、送检、自检、比对等。
5.质量控制5.1使用的质控品5.2质控周期5.2.1每一批次标本均需运行一次质控。
5.2.2每一批标本最大量为：44个标本。
5.3变异系数CV<20%5.4质控判断标准即时质控法5.5失控处理：对质控失控需查找原因并进行分析5.5.1先观察整块酶标板显色是否正常。
5.5.2查找操作过程是否按照SOP文件进行。
5.5.3质控品S/CO值>3SD或质控品S/CO值<3SD，结合模式报告结果。
6.操作步骤6.1选用试剂：北京贝尔生物工程股份有限公司6.2平衡：从冷藏环境中取出的试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔反应条应放置室温平衡30分钟后方可使用，余者应及时放入有干燥剂的自封袋封存于冰箱中备用。
在平衡试剂的同时，待测标本需放置室温平衡30分钟后再行测试。
6.3配液：将20×洗涤液用纯化水做20倍稀释后备用。
配制好的洗涤液如用不完可放置2-8℃冷藏储存，使用前应放置室温平衡20分钟后方可使用。
6.4加样：用移液器在反应孔中分别加入阴、阳性对照血清和CP-IgM质控品各100ul，测定孔中加入样品稀释液100ul，再依次加入待测血清样品10ul（待测血清用生理盐水作1:10稀释），用封口膜封板。
ELISA方法的及步骤
ELISA方法的及步骤ELISA（酶联免疫吸附法）是一种常用于检测目标分子的方法，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
ELISA方法通过利用免疫试剂（如抗体）与待测物发生特异性结合，再通过酶的催化作用来检测和定量目标分子的存在。
1.血清或其他样品的制备：将待测样品（如血清、细胞上清液等）收集并处理，如离心去除固体颗粒物或红细胞。
将样品稀释至适当的浓度，以保证检测结果在测量范围内。
2.包被试剂的制备：将目标分子（如蛋白质、病毒等）或其相应的抗体溶解在缓冲液中，然后将溶液加入到固相（如酶标板）上，使目标分子或抗体固定在固相表面上。
接下来，将固相洗涤以去除未结合的试剂，防止非特异性结合的发生。
3.样品的添加：将制备好的样品加入到包被试剂的固相上。
样品中的目标分子或抗体（如抗原、抗体）与包被试剂表面的抗体或抗原发生特异性结合。
4.洗涤：将固相进行多次洗涤以去除未结合的样品成分。
洗涤步骤可以使用缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或TBS（三氯乙酸盐缓冲液）。
5.二抗的添加：将与目标分子或抗体结合的复合物的稳定剂（例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗）加入到固相上。
二抗与前一步骤中的特异性结合复合物再次发生特异性结合，形成二级结合复合物。
6.洗涤：将固相多次洗涤以去除未结合的二级抗体。
7.发色反应：在固相上加入一种含氢过氧化物（如TMB）的底物。
该底物与HRP酶发生反应，生成可测量的色素产物。
发色反应的发生时间应根据实验需求进行控制，以确保准确的测量。
8.反应终止：通过向反应混合物中添加酸（如硫酸）或碱（如氢氧化钠）等溶液来终止发色反应。
终止反应后，反应混合物中的混浊液体会变为蓝色或黄色。
9.信号测量：通过光谱法（如吸光度法）测量混合物的光密度，来反映目标分子或抗体的含量。
使用酶标仪可以读取光密度值，并将其与标准曲线进行比较以确定目标物的浓度。
ELISA方法的优点包括高灵敏度、高特异性、易于操作和较少的试剂消耗。
包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的规程
包涵体蛋白包被E L I S A 板检测抗体的规程集团标准化小组：[VVOPPT-JOPP28-JPPTL98-LOPPNN]包涵体蛋白包被E L I S A板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA 板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4℃过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的BufferA溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SKL的BufferA溶解（使用前混合，1.97mlBufferA加入0.03ml20％的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS）4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMSO溶解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4℃融化。
在ELISA板每孔加入100μLCBS。
将100μL抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100μL液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的BufferA做对照。
2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。
拍干！3、封闭：5%脱脂乳300μL，37℃温育2小时或4℃过夜。
ELISA操作流程
ELISA操作流程（一）、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的）1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度；5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法（用于检测未知抗体）1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min；3. 封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度；5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照，室温或37℃孵育30-60min；7. 洗板：同步骤2；8.加酶标抗体：按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体（抗抗体），室温或37℃孵育1小时；酶标抗体的稀释按产品说明书；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程
包涵体蛋白包被E L I S A 板检测抗体的流程集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-包涵体蛋白包被E L I S A板检测抗体的流程一、包涵体包被抗原制备：在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4℃过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的BufferA溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SKL的BufferA溶解（使用前混合，1.97mlBufferA加入0.03ml20％的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS）4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMSO溶解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4℃融化。
在ELISA板每孔加入100μLCBS。
将100μL抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第二竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL 加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100μL液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的BufferA做对照。
2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。
拍干！3、封闭：5%脱脂乳300μL，37℃温育2小时或4℃过夜。
ELISA法检测抗体效价
ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。
指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。
②用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。
③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。
（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
②加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。
甩掉其中液体，吸水纸上拍干。
③共洗涤3次。
④用纯水再洗两次。
（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。
②洗涤后加入封闭液300 ul/孔。
③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。
④封闭之后无需洗涤。
（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。
同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。
②加入一抗100 ul/孔。
③孵育：37℃，1h。
（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。
②洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。
③孵育：37℃，45 min。
（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mgOPD（3-4粒），迅速混匀。
待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。
注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。
底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。
ELISA操作流程
ELISA操作流程（一)、基本操作流程方法一双抗体夹心法（用于检测未知抗原的)1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。
2.洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280—300ul/孔），漂洗2—3次，每次3-5min;3。
封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时,也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液；4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品（含未知抗原)稀释至所需浓度;5。
标准液:用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）；6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照,室温或37℃孵育30-60min;7. 洗板：同步骤2；8。
加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时；9. 洗板：同步骤2；10. 加底物液显色:按100—150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。
12. 结果判定:可于白色背景上，直接用裸眼观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处测OD值。
检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
方法二间接法(用于检测未知抗体)1. 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤2-3次；2。
洗板：次日弃去孔内液体,在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3—5min；3。
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包涵体蛋白包被E L I S A 板检测抗体的流程
This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
包涵体蛋白包被ELISA板检测抗体的流程
一、包涵体包被抗原制备：
在包涵体蛋白尿素溶解后不能浓缩或者置换溶剂的情况下，可以采取直接使用包涵体尿素溶解液直接作为检测原包被ELISA板。
（1）完成包涵体的制备和洗涤流程。
（2）按照常规流程溶解使用8M尿素或者1%SKL（十二烷基肌氨酸钠）溶解包涵体。
剧烈震动后，室温静置30分钟至2小时或者4℃过夜，使其缓慢溶解。
注：每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含8M尿素的Buffer A溶解；或者每100mL细菌提取的包涵体使用2mL含1%SKL的Buffer A溶解（使用前混合，1.97 ml Buffer A 加入0.03 ml 20％的SKL贮存液）。
（3）抗原稀释：使用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液（CBS）4倍稀释包涵体溶解液，分装冻存-20℃冰箱，减少冻融次数。
注意必须由少到多逐渐加入CBS，边加边震荡，以免试剂浓度变化造成的蛋白沉淀。
DMSO溶解的用CBS稀释4倍。
加入1:2-5倍PBS/TE/SW液体后切胶磨碎，4度放置3-7天，最高转速4度离心取上清冻存。
二、包涵体包被抗原浓度的确定：
1、稀释抗原：取出包涵体抗原，4℃融化。
在ELISA板每孔加入100μL CBS。
将100μL
抗原加入ELISA板第一竖排孔中；吹打4-5次后，吸出100μL加到第二竖排孔中；
吹打4-5次后，吸出100μL加到第三竖排孔中，一次类推，最后一排吸出的100μL 液体弃去。
注：每种抗原至少稀释3行，一行阳性血清检测，一行阴性血清对照，一行使用含8M尿素的Buffer A做对照。
2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在
ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。
拍干！
3、封闭：5%脱脂乳300μL，37℃温育2小时或4℃过夜。
弃去孔内溶液，用PBST洗3
次，拍干！。
封闭不彻底会导致假阳性！
4、稀释阳性血清：在本实验中，傅强的阳性血清和李仕超的阴性血清均做1000倍稀
释。
5、加样：将100μL稀释好的血清加入上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1-2小时。
用PBST洗3次，拍干！。
6、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗100μL。
37℃孵育不超过1
小时，PBST洗涤3次，拍干！。
7、加底物液显色：各反应孔中加入100μL TMB（避光），37℃ 10-30min显色。
注：商品化的TMB其实是TMB和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过1个月都会导致试剂失效。
8、终止反应：于各反应孔中加入50μL 2M浓硫酸。
9、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越
强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”、“－”号表示。
也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
10、结果分析：观察阴性对照是否也发生反应；选择检测阳性的最高稀释倍数前3-4孔
的稀释度作为最佳包被浓度。
例如，阳性血清如果前8孔为阳性，那么以后检测时抗原可以做24-5稀释后包板为宜。
三、包涵体包被ELISA板检测未知抗体：
1、稀释抗原：按照前期实验结果，用CBS稀释抗原。
每孔加入100μL抗原稀释液。
2、包被：4℃过夜或37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用PBST洗3次（洗涤方法：在
ELISA孔中加满PBST，室温静置5分钟后弃去，反复三次）。
拍干！
3、封闭：加入300μL 5%脱脂乳，37℃温育2小时或4℃过夜。
弃去孔内溶液，用PBST
洗3次。
拍干！封闭不彻底会导致假阳性！
4、加样：将25-100μL 细胞上清或者待检血清加入上述包被孔中，置37℃孵育1-2小
时或4℃过夜。
用PBST洗3次，拍干。
（根据实验设计，同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔）
5、加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标二抗100μL。
37℃孵育不超过1
小时，PBST洗涤3次。
拍干！
6、加底物液显色：各反应孔中加入100μL TMB（避光），37℃ 10-30min显色。
注：商品化的TMB其实是TMB和双氧水的混合物，长期光照、高温甚至生产日期超过1个月都会导致试剂失效。
7、终止反应：于各反应孔中加入50μL 2M浓硫酸。
8、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越
强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”、“－”号表示。
也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
计算公式：（待测样OD－空白OD）/（阴性对照OD－空白OD）。
大于2.1可判读为阳性。
试剂与耗材
（1）SDS裂解液200mL
（2）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M CBS碳酸盐缓冲液）：（3）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）：
（4）封闭液：
（5）终止液（2 M H
2SO
4
）：。