最新微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案
六、验证内容
1.供试液的制备
1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。

1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。

1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。

备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

2.菌液制备
2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。

2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。

加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。

3.计数方法的验证
3.1.需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）
所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。

为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先
应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。

3.1.1.试验组
取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基 15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

—取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。

平行制备2个平皿。

3.1.2.菌液组
—取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。

各平行制备2个平皿。

—取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。

各平行制备2个平皿。

3.1.3.供试品对照组
—取的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注15～20 ml温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃倒置培养3天点计菌落数，沙氏葡萄糖琼脂培养基20～25℃倒置培养5天点计菌落数。

各组平行制备2个平皿。

3.1.
4.结果判断
3.1.
4.1计算公式：
稀释剂对照组菌数的回收率=
（稀释剂对照组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数
试验组菌数的回收率=
（试验组的平均菌落数－供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数
3.1.
4.2判定标准：
实验组、稀释剂对照组（如有）的菌数回收率应在0.5～2之间。

若各试验菌的回收率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

3.1.5试验结果
供试品批号、、。

结果判定：
验证人： 复核人： 日期： 日期： 4.控制菌检查
4.1.（大肠埃希菌）的验证 4.1.1.试验组
取的供试液ml （取相当于1g 或1ml 供试品的供试液），小于100cfu 的大肠埃希菌菌悬液1ml ，加至约100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养18～24小时。

4.1.2.阴性对照组
取pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液10ml ，加至约100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养18～24小时。

4.1.3.阳性对照组
取小于100cfu 的大肠埃希菌菌悬液1ml ，加至约100ml 的胰酪大豆胨液体培养基，于30～35℃培养18～24小时。

4.1.4.检查
取上述培养物
1ml ，接种至含100ml 麦康凯液体培养基内培养，42～44℃培养24～48小时。

取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上30～35℃培养18～72小时。

检查结果如下： 第一次试验结果： 供试品批号：
第二次试验结果：供试品批号：
第三次试验结果：供试品批号：
标准：阳性对照和试验组应检出大肠埃希菌，阴性对照应无菌生长。

结果判定：
验证人：复核人：
日期：日期：
备注：采用以上供试液制备方法，分别对需氧菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查法进行方法验证时，若结果不能达到各标准时，应继续采用其他方法（如培养基稀释法、薄膜过滤法等）消除供试品的抑菌活性，重新进行方法验证。

七、验证异常情况处理
本次验证实施人员异动情况：□发生变化□未发生变化，发生异动情况描述如下：
本次验证测试仪器校验情况：□符合要求□不符合要求，不符合处理情况描述如下：
本次验证实施异常情况：□有异常□无异常；异常处理情况：□已处理完成□未处理完成。

实施小组组长：日期：审核人：日期：。