第四章 细菌耐药性检测
细菌耐药性监测
细菌耐药性监测
1.细菌耐药性监测监测临床分离细菌耐药性发生情况,包括临床上一些重要的耐药细菌的分离率，如MRSA.耐万古霉素肠球菌(VRE)和泛耐药的铜绿假单胞菌(PDR-PA),广谱β-内酰胺酶(ESBLS)的革兰阴性细菌等。
2.监测调查对象临床标本分离的病原菌。
3.监测内容细菌、抗菌药物、药物敏感结果。
4.监测方法统计、分析微生物室分离的细菌和药物敏感结果。
5.资料分析
(1)不同病原体的构成比。
(2)主要革兰阳性细菌的构成比及对抗菌药物的耐药率。
(3)主要革兰阴性细菌的构成比及对抗菌药物的耐药率。
(4)MRSA占金黄色葡萄球菌的构成比及分离绝对数,对抗菌药物的耐药率。
(5)PDR-PA的构成比及绝对分离数。
(6)VRE占肠球菌属细菌的构成比及分离绝对数,对抗菌药物的耐药率。
(7)革兰阴性细菌ESBLs的构成比及分离绝对数,对抗菌药物的耐药率。
6.总结和反馈结合以往资料总结并公布监测结果，向临床医师和医院药事管理机构反馈。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法传统检测方法主要包括药敏试验和漏斗法。
药敏试验通过将不同的抗生素与待检细菌进行共培养，观察细菌的生长情况，可以确定细菌对不同抗生素的敏感性。
漏斗法又称为浓度梯度法，将一系列不同浓度的抗生素加入含有细菌的琼脂平板培养基中，观察细菌生长的情况，通过最小抑菌浓度（MIC）来确定细菌的耐药性。
然而，传统的检测方法有一些不足之处，包括需要较长的检测时间、操作复杂、耗时耗力、存在人为误差等。
因此，近年来，分子检测方法逐渐应用于细菌耐药性的检测。
分子检测方法主要包括PCR技术、基因芯片技术和下一代测序技术。
PCR技术（聚合酶链式反应）是一种快速、高效、敏感的检测技术，通过扩增特定基因片段来判定细菌的耐药性。
该技术可以快速检测出是否存在耐药基因，并可通过测序等方法进一步确定具体基因型。
基因芯片技术则可以同时检测多个耐药相关基因，具有高通量、快速、精确度高的优点。
而下一代测序技术则可以对细菌的基因组进行全面分析，包括基因序列、变异信息等，对于耐药性的研究提供了更多的信息。
传统检测方法和分子检测方法在细菌耐药性检测中都具有一定的适用性，可以根据具体的实验要求和资源情况选择合适的方法。
对于临床应用而言，传统检测方法的优势在于成熟、经济、稳定，但无法提供细菌的详细基因型信息；而分子检测方法则具有高通量、高灵敏度、高特异性的优势，但需要较复杂的实验设备和操作技术。
细菌耐药性的检测方法在临床、食品安全、环境监测等领域具有重要的应用价值。
通过检测细菌的耐药性，可以指导临床合理使用抗生素，减少抗生素滥用，避免耐药细菌的产生和传播；在食品安全领域，可以掌握食品中耐药细菌的情况，保障食品的质量安全；在环境监测领域，可以及时发现环境中的耐药菌，为环境卫生管理提供参考依据。
综上所述，细菌耐药性的检测方法既有传统的药敏试验和漏斗法，也有分子检测的PCR技术、基因芯片技术和下一代测序技术。
各种方法各有优缺点，可以根据具体实验需求和资源条件选择合适的方法。
-细菌耐药性检测-精品医学课件
21
CLSI规定的药敏试验的方法？
药敏试验的结果对临床的指导意义？ 临床医生如何解读药敏试验的结果？
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抑菌试验
方法： 选择抗菌药物 特定的培养基，接种一定量的测试菌， 一定浓度的药物，培养一定的时间
结果阅读：抑菌圈直径，最低抑菌浓度
金黄色葡萄球菌ATCC25923：0.12~1ug/ml 大肠埃希菌ATCC25922：0.015~0.12ug/ml
药敏试验的质量控制：抑菌环范围有95%的可信区间， 即20个试验的结果中只能≦1个结果超出表中所列范围。
待测菌株对氧氟沙星的MIC结果解释标准
抗菌药物
耐药R
敏感S
氧氟沙星ug/ml
≧8
弃去
1ml
蒸馏
水
640 320 160 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0 药物浓度 U/ml
MIC
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肉汤稀释法
？
混
混清
MIC？
4；8 ； 16；32； 64；128；256 ug/ml 40
肠杆菌科质量控制
质控菌株：
待测菌不同，质控菌 株、培养条件等也不 同
即标准菌株，如大肠埃希菌ATCC25922
检测值： 最小抑菌浓度：肉眼可见完全抑制细菌生长的最 低药物浓度。Minimal inhibitory concentration，MIC 。 最小杀菌浓度： 在体外能够使细菌总数减少(杀 灭)99.9% 以上的最低药物浓度。
minimal bactericidal concentration，MBC
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选药指南
D组 包括仅限于泌尿系感染使用的药物（如呋喃妥
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA 测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
《细菌耐药性监测》课件
本课件将介绍细菌耐药性及其监测。细菌耐药性是细菌对抗生素的耐药能力， 对公共卫生和临床治疗都具有重要影响。
细菌耐药性的定义
细菌耐药性是指细菌对抗生素或其他药物的抵抗力，使其在治疗时无法有效消除细菌感染。
细菌耐药性监测的重要性
公共卫生
监测细菌耐药性可以帮助制 定有效的公共卫生政策，预 防细菌感染的传播和扩散。
细菌耐药性监测的挑战和困境
新的耐药机制
细菌不断进化，产生新的耐药 机制，挑战现有的监测方法和 治疗策略。
数据收集和分析
大规模数据的收集和分析是一 项复杂的任务，需要跨学科的 合作和高效的数据管理。
多样性和流动性
细菌耐药性具有多样性和流动 性，跨越国界和领域，需要全 球合作应对。
细菌耐药性监测的未来发展方向
1
基因测序技术
Hale Waihona Puke 利用高通量基因测序技术，快速识别细菌耐药性基因，实现快速监测和定位。
2
大数据分析
应用人工智能和机器学习算法，对大规模的耐药性数据进行分析和预测，提高监 测效率。
3
新型抗生素研发
加强新型抗生素的研发和推广，应对不断变化的细菌耐药性。
细菌耐药性监测的应用和意义
指导治疗
根据细菌耐药性监测结果，指导临床医生选择最有效的抗生素治疗细菌感染。
临床治疗
监测细菌耐药性可以指导临 床医生选择合适的抗生素治 疗细菌感染，提高治疗效果。
药物开发
监测细菌耐药性可以为研发 新的抗生素和药物提供数据 支持，应对不断变化的细菌 耐药性。
常见的细菌耐药性监测方法
1 药敏试验
通过培养细菌和敏感试验 药物，确定细菌对抗生素 的敏感度和耐药性。
细菌耐药性监测和防控管理制度
细菌耐药性监测和防控管理制度第一章总则第一条目的和依据1.为了保障医院医疗质量，有效监测和防控细菌耐药性的传播和扩散，订立本规章制度。
2.本制度依据《中华人民共和国传染病防治法》《中华人民共和国医疗机构条例》等相关法律法规。
第二条适用范围1.本制度适用于医院内全部科室、各级医务人员、护理人员等相关人员。
2.各科室依据本制度的要求，订立符合本科室特点的相关管理方法和操作规程。
第三条定义1.细菌耐药性：指细菌对抗生素或其他药物产生的抗药物性。
2.监测：指对细菌耐药性进行系统、长期的监测和评估。
3.防控：指对细菌耐药性的传播和扩散采取各种措施，包含防备、监测、隔离、教育、培训等。
第二章细菌耐药性监测和评估第四条细菌耐药性监测和评估的目的1.确定医院细菌耐药性的流行情况和趋势。
2.发现和监测细菌的变异和新显现的耐药性。
3.评估细菌耐药性对患者治疗和医院感染掌控的影响。
第五条细菌耐药性监测和评估的内容1.对呼吸系统、消化系统、泌尿系统、血液系统、皮肤和软组织等科室常见感染细菌的耐药性进行监测。
2.对每一批次进货的抗生素进行抽样检测。
3.对医院内患者的细菌耐药性进行监测，并将监测结果报送给医疗质量管理部门和临床科室。
第六条细菌耐药性监测和评估的方法1.手记标本：依据不同感染部位和病情，选择合适的标本进行手记。
2.分别培养：对手记的标本进行细菌分别和培养，并进行鉴定。
3.药敏试验：对培养的细菌进行药敏试验，确定其对不同抗生素的敏感性和耐药性。
4.数据统计和分析：对检测结果进行统计和分析，形成监测报告。
第三章细菌耐药性防控第七条医院细菌耐药性防控的原则1.提高医务人员的感染掌控和手卫生意识。
2.合理使用抗生素，避开滥用和过度使用。
3.定期培训和教育医务人员，提高细菌耐药性防控知识和技能。
第八条感染防备与掌控1.严格执行无菌操作规范，避开交叉感染。
2.加强医疗废物管理，确保废物的正确处理，防止感染扩散。
第九条手卫生1.医务人员在接触患者前后必需进行手卫生。
细菌耐药监测制度
细菌耐药监测制度第一章总则第一条为了提高细菌耐药性监测的科学性、有效性和规范性，保障患者的医疗安全和公共卫生，订立本规章制度。
第二条本制度适用于本医院全部临床科室、医技科室以及临床研究单位。
第三条细菌耐药性监测是指对不同类型的细菌在不同人群中的耐药性情况进行监测分析的工作。
第四条细菌耐药性监测的目的是及时掌握细菌耐药性的变动趋势，为合理使用抗生素、订立感染掌控措施和改进治疗供应科学依据。
第二章细菌耐药性监测的对象第五条细菌耐药性监测的对象包含但不限于以下几类细菌：1.革兰阳性菌：如金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌等；2.革兰阴性菌：如大肠杆菌、产气荚膜梭菌、克雷伯菌等；3.难以培养的非典型菌：如结核分枝杆菌、麻风杆菌等。
第三章细菌耐药性监测的内容与方法第六条细菌耐药性监测的内容包含以下几方面：1.细菌的种类和数量；2.细菌对不同抗生素的耐药性；3.细菌耐药性的变动趋势；4.细菌耐药性相关的流行病学特征。
第七条细菌耐药性监测的方法包含以下几种：1.手记标本：依据不同疾病和临床需要，手记相应的标本，如血液、尿液、呼吸道分泌物等；2.细菌培养与分别：将标本作无菌处理后，进行培养分别，得到纯种细菌菌株；3.抗生素敏感试验：对不同细菌菌株进行抗生素敏感试验，获得耐药性数据；4.统计分析与报告：对细菌耐药性数据进行统计分析，编制监测报告，及时通报相关科室和管理部门。
第四章细菌耐药性监测的管理第八条细菌耐药性监测的责任主体为医院感染掌控科。
第九条医院感染掌控科的职责包含但不限于以下几方面：1.负责组织和实施细菌耐药性监测工作；2.统筹协调各临床科室和医技科室的合作，确保监测工作的顺利进行；3.订立和修订细菌耐药性监测工作流程和操作规范，保证工作的质量和规范；4.对监测结果进行分析和解读，供应科学依据和建议，引导临床用药和感染掌控工作；5.定期向医院领导和相关部门报告监测结果，及时通报紧要的细菌耐药性情况。
第十条各临床科室和医技科室的职责包含但不限于以下几方面：1.搭配医院感染掌控科的工作，按要求进行标本手记和数据录入；2.及时向医院感染掌控科报告细菌耐药性相关信息，如感染病例、抗生素使用情况等；3.搭配医院感染掌控科的要求，参加细菌耐药性监测结果的分析和讨论，并接受相关建议。
抗菌药物敏感试验细菌耐药性检测ppt课件
8
判读抑菌浓度
（MIC ug/ml)
016
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E test 法特点
优点
连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好 （相关系数为0.9）.可测MIC。
操作简单，影响因素少，稳定性高。
缺点：E试条较昂贵; 不适用于生长缓慢的苛养菌。
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31
四、联合药物敏感试验
联合药物意义
盖有15--20个对倍稀释浓度的宽度范围。
016
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育，围
绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交
点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的MIC。
依照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。
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有菌生长区 无菌生长区
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27
椭圆形细菌 生长抑制区
完整最新版课件
40
四种方法
比例法 放射同位素法 绝对浓度法 耐药率法
•直接法：直接采用图片阳 性的体液标本。（须经充 分消化五杂菌）
•间接法：经分离纯培养后 的次代培养菌。
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41
间接比例法（WHO推荐）
Middlebrook7H10琼脂 培养3周
无药
药1
药2
药3
不含药的对照格菌落数应为50~150 敏感：含药格无结核杆菌生长，
抗菌药物与细菌 纸片含量 抑菌圈直径：mm 相应MIC μg/ml 耐药 中介度 敏感 耐药 敏感
丁胺卡那霉素 氨苄青霉素
测肠杆菌 测葡萄球菌 测嗜血杆菌 测肠球菌
30μg ≤14 15-16 ≥ 17 ≥32 ≤16
10μg 10μg 10μg 10μg
第4章细菌耐药性检测
细菌耐药性的遗传机制
• 固有耐药性:
指细菌对某些抗菌药物的天然不敏感， 也称为天然耐药性细菌 其耐药基因存在于染色体上，具有种属 特异性,如肠道杆菌对青霉素的耐药
• 获得耐药性:
指细菌DNA的改变导致其获得耐药性 表型
耐药基因来源于基因突变或通过接合、 转化、转导方式获得。耐药基因在质粒、 转座子、整合子等可移动的遗传元件介 导下进行转移并传播
5.平板置室温下干燥3~5分钟，贴 抗菌药物纸片
6.临床和实验室标准协会(CLSI)制定 的抗菌药物选择原则
根据细菌种类选择相应的抗菌纸片
肠杆菌科： 氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、 头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培南、氨曲南、 庆大霉素 葡萄球菌属： 头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉素、 环丙沙星、庆大霉素、利福平
• 无关作用——两种药物联合作用的活 性等于其单独活性
• 拮抗作用——两种药物联合作用显著 低于单独抗菌活性
• 累加作用——两种药物联合作用时的 活性等于两种单独抗菌活性之和
• 协同作用——两种药物联合作用显著 大于其单独作用的总和
联合抑菌试验
• 单药纸片搭桥法（定性粗筛） • 棋盘稀释法（常用的定量方法）
6.用微量加样器接种菌液100μl/孔， 盖上盖板 同时作阳性、阴性对照 35℃孵育16~20h
7.手工看浊度或仪器自动判读
• 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低 药物浓度为MIC
• 按照CLSI标准报告细菌对某抗菌药物 为敏感、耐药、中介
GNS-12G-菌显色药敏（MIC）鉴定板：
宏量肉汤稀释法
结合了扩散法和稀释法的特点，试条含有 连续的呈浓度梯度变化的抗生素，能够准 确、可靠地读出细菌的MIC
操作方法
细菌耐药性检测
细菌遗传变异
产β-内酰胺酶菌株 药敏试验的特点
可水解青霉素和半合成青霉素以及第一代、
第二代头孢菌素，多数可被酶制剂所抑制
对第三代、第四代头孢菌素、碳青霉烯类以
及酶抑制剂复方制剂均高度敏感。
细菌遗传变异
超广谱β－内酰胺酶是质粒介导
的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚
氨基β-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺
细菌遗传变异
产碳青霉烯酶菌株的药敏试验特点
产生菌：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、部 分肠杆菌科细菌 可水解各种广谱β-内酰胺类抗生素包括第 三代、第四代头孢菌素和酶抑制剂复方制剂， 头霉素类、碳青霉烯类等 多为泛耐药菌株，并同时对喹诺酮类和氨基 糖苷类耐药。
细菌遗传变异
肠杆菌科细菌
大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变
细菌遗传变异
目前G＋球菌的主要耐药问题
葡萄球菌中最主要的问题是MRSA，耐药性高，致 病力强，引起全身感染病死率可高达50％！ MRSA应报告对所有β-内酰胺类抗菌药物耐药，常
类抗生素，并可被克拉维酸等β-内酰
胺酶抑制剂所抑制的一类β-内酰胺酶。
细菌遗传变异
产ESBLs菌株的药敏试验特点
ESBLs菌株：主要为大肠埃希氏和肺炎克雷伯 菌。 可水解各种β-内酰胺类抗生素包括第三代的 头孢他定、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南等含 氧亚氨基侧链的头孢菌素 多数可被酶抑制剂所抑制 对碳青霉烯类高度敏感，对头霉素类、头孢哌 酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等复方制剂多 数呈敏感。
细菌遗传变异
细菌产生耐药性的原因
服药疗程不足： 用药不当： 重复用药： 剂量不足： 药物交互作用：
细菌遗传变异
细菌耐药性检测
4
琼脂扩散法适用范围
适用范围 在MH琼脂上快速生长的需氧或兼性厌氧细菌
经改良后也适用于 –链球菌-添加5%羊血 –嗜血杆菌属-使用HTM培养基 –淋病奈瑟菌-使用GC培养基
抗生素在琼脂平板中的扩散方式
含药纸片 含药小杯 含药小孔
琼脂扩散法材料
含药纸片 MH培养基 菌株 标准比浊管
琼脂扩散法操作示意图
酮 、口服用头孢克肟、头孢布坦 、头孢迪尼、头孢泊肟 ）：产 β-内酰胺酶革兰阴性菌
四代头孢菌素
（头孢匹罗、头孢匹美）：肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌
其他β-内酰胺类抗生素分类及抗菌谱
头霉素类
（头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑）：革兰阳性菌、厌氧菌
氧头孢烯类
产β-内酰胺酶阴性菌、产酶的金黄色葡萄球菌
单环β-内酰胺类抗生素
两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和
无关作用：FIC指数1.0-2.0
两种药物联合作用的活性等于其单独活性
拮抗作用：FIC指数>2.0
两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性
FIC=联合用药时甲药MIC/单独应用甲药时MIC+联合 应用乙药时MIC/单独应用乙药时MIC
联合药敏试验的结果图示
§1 临床常用抗菌药物
•3
抗菌药物概述
定义
抗菌药物（agents）：系指具杀菌或 抑菌活性的各种药物。
分类
抗生素 ---由真菌、放线菌或细菌等微生物产生的能杀灭
或抑制其他微生物的物质。 化学疗剂 ---治疗由微生物引起疾病的化学合成药物。 消毒杀菌剂
β-内酰胺类抗生素分类
以ug/mL或U/mL表示。 最低杀菌浓度测定
（Minimal Bactericida Concentration,MBC) 抗菌药物能够杀死细菌所需要的最低浓度。以 ug/mL或U/mL表示。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA 基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml 的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
微生物04章 细菌耐药性检测.
三、大环内酯类
目前国内常用的有红霉素、柱晶白霉素、麦迪霉素、乙酰 螺旋霉素。新一代大环内酯类有克拉霉素、罗红霉素、地红霉 素、氟红霉素、阿奇霉素、罗地霉素和美欧卡霉素
其作用特点和机制是：①可逆结合细菌核糖体50S大亚基的 23S单位，抑制细菌蛋白质合成和肽链延伸；②肺部浓度较血清 浓度高；③新一代大环内酯类具有免疫调节功能，能增强单核巨噬细胞吞噬功能
第四章 细菌耐药性检测
目录
第一节 临床常用抗菌药物 第二节 抗菌药物敏感试验 第三节 细菌耐药机制 第四节 细菌耐药检测
第一节 临床常用抗菌药物
一、β-内酰胺类
（一）青霉素类
青霉素类抗生素主要包括天然青霉素、耐青霉素酶青霉素 、广谱青霉素、青霉素+β-内酰胺酶抑制剂
（二）头孢菌素类
头孢菌素类根据发现的先后和抗菌作用将其命名为第一代 、第二代、第三代、第四代头孢菌素
一、药敏试验的抗菌药物选择
药敏试验的折点遵照每年最新公布的CLSI标准进行。敏感 （susceptible, S）指当使用常规推荐剂量的抗菌药物进行治 疗时，该抗菌药在患者感染部位通常所能达到的浓度可抑制分 离菌株的生长。中介意味着该药常规剂量治疗该部位的感染可 能有效；若某药在高剂量使用时是安全的（如β-内酰胺类药物 ），则中介意味着高于常规剂量给药可能有效。耐药 （resistant, R）指使用常规推荐剂量的抗菌药物治疗时，患 者感染部位通常所能达到的药物浓度不能抑制菌株的生长；和/ 或证明MIC或抑菌圈直径可能处于特殊的微生物耐药机制范围（ 如β-内酰胺酶），抗菌药物对菌株的疗效尚未得到临床治疗研 究的可靠证实
六、磺胺类和三甲氧苄氨嘧啶
磺胺类与对氨基苯甲酸化学结构相似，对氨基苯甲酸是细菌 叶酸合成所需的重要因子，磺胺类完全抑制细菌对氨基苯甲酸转 变成二氢叶酸。三甲氧苄氨嘧啶（TMP）是抑制二氢叶酸还原酶 的一种嘧啶类似物，干扰叶酸代谢及其后的嘧啶合成和细菌的一 碳单位代谢
细菌耐药性检测PPT医学课件
（一） PCR 扩增 （二） PCR-RFLP分析 （三） PCR-SSCP 分析 （四） PCR-线性探针分析 （五） 生物芯片技术 （六） DNA测序
细菌耐药性的生物化学机制
灭活酶和钝化酶的产生 1.β-内酰胺酶 水解药物β-内酰胺环使酰胺键断
裂而失去抗菌活性 。 2.氨基糖苷类钝化酶 有3类：乙酰转移酶(AAC)、
一 .药敏试验的抗菌药物选择（NCCLS） 二．K-B纸片琼脂扩散法 三．稀释法 四．E 试验 五、联合药物敏感试验和杀菌试验
第三节 细菌耐药性与产生机制
一、细菌耐药性定义 二、细菌耐药性的产生机制
第四节 细菌耐药性检测方法
一、 细菌耐药表型检测 二、β -内酰胺酶检测
细菌的外膜上特殊的药物泵出系统 使菌体内 的药物浓度不足导致耐药 。铜绿假单胞菌外膜上 有一种蛋白OprK，泵出多种抗生素 ，是产生耐药 的重要机制 。
细菌耐药性的生物化学机制 生物膜形成
生物膜基质是细菌分泌的多聚物质、吸收的 营养物、代谢产物、细胞溶解产物和当时周围 环境中的微粒材料和碎石组成的复合体。
Ⅰ
抑菌
细胞质
（bacteriostatic）
Ⅱ
杀菌
染色体
（bactericidal）
Ⅲ
溶菌 （bacteriolytic）
细胞壁
作用机制 可逆性抑制：
1) 转录 2) 转译 3)细胞代谢 不可逆地阻遏 基因复制
使细胞溶解
第一节 临床常用抗菌药物
一、抗细菌药物 二、 抗厌氧菌药物
第二节 体外抗菌药物敏感试验
抗菌药物发现史 上几个重要的里程碑
1959年，英国科学家Chain利用大肠杆菌酰 胺酶，从青霉素制备中间体6APA获得成功， 开创了半合成抗生素的新时代。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测方法1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。
也可通过以下方法进行检测：（1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。
（2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。
（3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。
若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶（4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。
2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。
临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。
如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。
3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。
检测抗菌药物耐药基因的方法主要有：PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌和对1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或MIC≥0.5цg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）。
细菌耐药性检测方法
细菌耐药性检测要领之阳早格格创做1、细菌耐药表型检测：推断细菌对于抗菌药物的耐药性可根据NCCLS尺度，通过丈量纸片扩集法、肉汤密释法战E 考查的抑菌圈直径、MIC值战IC值赢得.也可通过以下要领举止检测：（1）耐药筛选考查：以简单药物的简单浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选考查，临床上时常使用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类下火仄耐药的肠球菌等.（2）合面敏感考查：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或者耐药合面MIC），而没有使用测定MIC时所用的系列对于倍密释抗死素浓度尝试细菌对于抗菌药物的敏感性，称为合面敏感考查.（3）单纸片协共考查：单纸片协共考查是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阳性杆菌的纸片琼脂扩集考查.若指示药敏纸片正在往背阿莫西林/克推维酸目标有抑菌圈夸大局面（协共），证明尝试菌爆收超广谱β-内酰胺酶（4）药敏考查的仪器化战自动化：齐自动细菌审定及药敏分解仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等使用合面敏感考查的本理可半定量测定抗菌药物的MIC值.2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometrictest）战头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）.临床时常使用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶考查可赶快检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫推菌战肠球菌对于青霉素的耐药性.如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对于青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌战肠球菌对于青霉素（包罗氨基、羧基战脲基青霉素）耐药.3．耐药基果检测：临床可检测的耐药基果主要有：葡萄球菌取甲氧西林耐药有闭的MecA基果,大肠埃希菌取β-内酰胺类耐药有闭的blaTEM、blaSHV、blaOXA基果，肠球菌取万古霉素耐药有闭的vanA、vanB、vanC、vanD基果.检测抗菌药物耐药基果的要领主要有：PCR扩删、PCR-RFLP分解、PCR-SSCP 分解、PCR-线性探针分解、死物芯片技能、自动DNA测序4．特殊耐药菌检测（1）耐甲氧西林葡萄球菌检测：对于 1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10㎜，或者其MIC≥4цg/ml的金黄色葡萄球菌战对于1цg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17㎜，或者MIC≥цg/ml的凝固酶阳性葡萄球菌被称为耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）.对于MRS没有管其体中药敏考查截止，所有的β-内酰胺类药物战β-内酰胺/β-内酰胺酶压造剂均隐现临床无效；绝大普遍的MRS常为多沉耐药，耐药范畴包罗氨基糖甙类、大环内酯类、四环素类等.（2）耐青霉素肺炎链球菌检测：当对于1ццg/ml均应视为耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）.临床治疗隐现PRSP对于氨卞西林、氨卞西林/舒巴坦、头胞克肟、头胞唑肟，临床治疗疗效很好，但是应检测对于头胞直紧、头胞噻肟战好洛培北等的MIC以推断是可对于那些抗死素敏感.（3）耐万古霉素肠球菌检测：肠球菌对于30цg万古霉素纸片抑菌圈直径≤14㎜或者MIC≥32цg/ml被称为耐万古霉素肠球菌（VRE）.针对于多沉万古霉素药物暂时尚无灵验治疗要领，但是对于青霉素敏感的VRE可用青霉素战庆大霉素共同治疗，若对于青霉素耐药而没有是下火仄耐氨基糖甙类可用壁霉素+庆大霉素.（4）产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌检测：超广谱β-内酰胺酶是一种能火解青霉素、广谱头孢菌素及单胺类的酶，主要由克雷伯菌、肠杆菌等细菌爆收.当通过筛选法时对于头孢泊肟、头孢他啶（10цg/片）抑菌圈≤22㎜或者氨直北、头孢噻肟（30цg/片）≤27㎜的菌株经头孢他啶（30цg/片）、头孢他啶/克推维酸（30/10цg）；头孢噻肟（30цg/片）、头孢噻肟/克推维酸（30/10цg）二组表型确证考查，其截止为二组中所有一组药物加克推维酸取没有加克推维酸的抑菌圈相比，删大值≥5㎜时推断为产ESBL菌株（图7-13）.产ESBL克雷伯菌战大肠埃希菌没有管其体中药物敏感考查截止怎么样，对于青霉素、头孢菌素战氨直北治疗无效.。
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临床常用抗菌药物
1、β-内酰胺类：青霉素类，头孢菌素类，单环类、头霉 素类等。
机制：与青霉素结合蛋白结合，抑制细菌细胞壁合成。 头孢抗菌效果： 对于革兰阳性球菌：一代>二代>三代 对于革兰阴性杆菌：三代>二代>一代 四代对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌几乎相同，并具有抗
假单胞菌作用。
临床常用抗菌药物
第四章
细菌耐药性检测
细菌耐药性产生的原因
1、细菌自身因素：基因突变或获得耐药基因质粒 2、经验性使用抗菌素：致使细菌形成耐药或中介 3、对于未确诊为细菌感染者使用抗生素 4、滥用广谱抗生素
抗菌药物作用机制
1、干扰细菌细胞壁的合成，使细胞不能生长繁殖 2、损伤细菌的细胞膜，破坏其屏障作用 3、影响细菌细胞蛋白质的合成，是细菌丧失生长 4、破坏核酸的代谢，阻碍遗传信息的复制 5、抑制细菌叶酸代谢等
效果更好。
抗菌药物敏感试验
抗菌药物联合用药可出现四种结果： ①无关作用：两种药物联合作用的活性等于其单独活性 ②拮抗作用：两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性 ③累加作用：两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗
菌活性之和 ④协同作用：两种药物联合作用显著大于其单独作用的总
和
细菌耐药机制
目的：达到控制感染性疾病。
抗菌药物敏感试验
A组（首选）：包括对特定菌群的常规试验并常规报告的 药物
B组：包括一些临床上重要的，特别是针对医院内感染的 药物，也可用于常规试验，但只是选择性地报告
C组：包括一些替代性或补充性的抗菌药物，在A、B组过 敏或耐药时选用
U组：仅用于治疗泌尿道感染的抗菌药物 O组，对该组细菌有临床适应症但一般不允许常规试验并
细菌耐药监测
2、肠球菌耐药性检测： 万古霉素耐药性检测、 氨基汤苷类高水平耐药检测
3、革兰阴性杆菌耐药性检测： 超广谱β-内酰胺酶检测、 碳青霉烯酶检测（EDTA协同试验和改良Hodge试验）
细菌耐药监测
4、青霉素耐药肺炎链球菌检测 5、碳青霉烯类耐药菌鲍曼不动杆菌检测
细菌耐药基因型检测（少用）
1、产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；（具专一 性）
2、抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、 DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶Ⅳ的改变等；（具专一性）
3、细菌膜通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道 蛋白丢失；
4、细菌主动外排系统的过度表达。
细菌耐药监测
细菌耐药表型监测 1、葡萄球菌耐药性检测： 青霉素耐药性和β-内酰胺酶检测（头孢硝噻吩纸片法）、 甲氧西林/苯唑西林耐药性检测、 VISA和VRSA检测、 诱导克林霉素耐药性检测
报告的药物。
抗菌药物敏感试验
试验方法： 1、稀释法：肉汤稀释法、琼脂稀释法 优点：精确，可靠，可用于研究 缺点：细菌生长情况不可查
抗菌药物敏感试验
2、纸片扩散法：半定量，最常用 影响因素： ①培养基厚度 ②观察时间 ③标准菌株对照 ④菌量
抗菌药物敏感试验
注意事项： ①挑取至少3个菌落制作待测菌液 ②接种时均匀密涂 ③贴片时，用无菌镊子轻轻触压纸片，使之与培养基充分
白质的合成和肽链的延伸； ②肺部浓度较血清浓度高 ③新一代大环内酯类具有免疫调节功能，能增强单核-革兰阳性菌无作用 作用机制： ①通过外膜孔蛋白和磷脂渗透进入细菌细胞 ②作用DNA旋转酶，干扰细菌DNA的复制、修复和重组。 5、糖肽类和环脂肽类 6、磺胺类和三甲氧苄嘧啶 7、四环素类 8、林可霉素类 9、氯霉素类
谢谢
接触，贴纸片后不能更改纸片位置 ④药敏纸片贴的数量要适量，一般9cm的平皿最多贴6张药
敏纸片 ⑤整个贴片过程应在15min内完成
抗菌药物敏感试验
3、E-test法：定量，但比稀释法更不准确。 4、联合药物药敏试验： 目的： ①治疗混合型感染； ②预防或推迟细菌耐药性的发生； ③联合用药可以减少计量以避免达到毒性计量； ④对某些耐药细菌引起的严重感染，联合用药比单一用药
2、氨基糖苷类： 机制： ①依靠离子的吸附作用，吸附在菌体表面，造成膜的损伤
②和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆结合，抑制mRNA的 转录和蛋白质的合成，造成遗传密码的错读，产生无意义 的蛋白质。
临床常用抗菌药物
3、大环内酯类 机制： ①可逆结合细菌核糖体50S大亚基的23S单位，抑制细菌蛋
抗菌药物敏感试验
意义： 1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导抗菌药物的临床应用 3、发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选
择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药 4、检测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感
染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。
抗菌药物敏感试验
药敏试验抗菌药物选择的原则： 1、考虑药物的临床疗效， 2、耐药菌株流行情况， 3、预防耐药菌株产生 4、经济等综合因素。