流式测凋亡原理步骤和结果判断

流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断

一、原理：

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。

二、步骤：

1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。

2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。

3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，

混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。

4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V

荧光，FL2通道检测PI荧光。同时以不加FITC- AnnexinV及PI的一管作

为阴性对照。

三、结果判断：

凋亡中晚期的细胞和坏死细胞其胞膜有损伤，PI能够穿透细胞膜而使DNA被PI着染产生红色荧光。而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞对于细胞活性鉴定的染料PI有抗染性，则不会有红色荧光产生，正常活细胞与之相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，呈现（FITC+/PI-）。