《仪器分析》第十四章_分子发光光谱法
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分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
仪器分析分子发光分析法讲课文档
• 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物 质的基态分子所吸收，即自吸收现象
第三十五页，共57页。
五、荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器
——主要由光源、单色器、样品池、 检测器和显示器组成。
第三十六页，共57页。
I0
I
光源
第一单色器
液池
检测器
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
em
①两个单色器
团 • 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与
苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电子， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强 度增强
第二十五页，共57页。
（2）减弱荧光的取代基
-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基 团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为 重原子效应。
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失 • 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程 • 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T 发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
第八页，共57页。
VR S2
IC
VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
第九页，共57页。
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
第三十五页，共57页。
五、荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器
——主要由光源、单色器、样品池、 检测器和显示器组成。
第三十六页，共57页。
I0
I
光源
第一单色器
液池
检测器
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
em
①两个单色器
团 • 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与
苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电子， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强 度增强
第二十五页，共57页。
（2）减弱荧光的取代基
-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基 团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为 重原子效应。
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失 • 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程 • 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T 发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
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VR S2
IC
VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
第九页，共57页。
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
光学分析法---分子光谱分析法
由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10-12s)， 因此，激发后的分子很快回到电子第一激发 单重态S1的最低振动能级．所以高于第一激 发态的荧光发射十分少见．
荧光发射
对大多数分子而言，当分子处于第一激发 单重态S1的最低振动能级时，分子返回基 态的过程比振动弛豫和内转换过程慢得 多．分子可能通过发射光子跃迁回
双光束分光光度计可很好地消除由于光 源强度变化对吸光度测量的影响，
双波长紫外可见分光光度计
双波长分光光度计中， 两个波长的吸光度几乎 同时测量，可测定背景 很强的混浊样品
多通道紫外可见分光光度计
使用光二极管阵列检测器，包含几百或上千个 检测元件同时测量不同波长处的光强，可的吸 收光谱。光谱信噪比优于传统扫描型仪器。
* n吸收带（弱） * 吸收带（强） 分子中电子离域程度高，结构刚性，取代基 为给电子取代基一般可以提高分子的发射。
结构刚性效应
取代基效应
有机化合物的外层轨道
紫外可见分光光度法
紫外吸收光谱法主要用于有机化合物的定性分 析和定量分析（通常是对纯物质的测定，如对 样品进行色谱分离之后检测；也可以用多波长 法进行两个或三个组分的检测）
激发态分子经过系间跨跃到达激发三重态后， 并经过迅速的振动弛豫到达第一激发三重态(T1) 的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返 回基态．此过程称为磷光发射。
磷光发射是不同多重态之间的跃迁．(即T1-S0) 故属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光 要长得多，约为10-3到10s。所以，将激发光从 磷光样品移走后，还常可观察到后发光现象， 而荧光发射却观察不到该现象。
特别是用于动态分析，在线分析，过程分析
有机化合物的定性分析
生色团的分析：紫外吸收光谱相同，不 能保证是同一化合物
荧光发射
对大多数分子而言，当分子处于第一激发 单重态S1的最低振动能级时，分子返回基 态的过程比振动弛豫和内转换过程慢得 多．分子可能通过发射光子跃迁回
双光束分光光度计可很好地消除由于光 源强度变化对吸光度测量的影响，
双波长紫外可见分光光度计
双波长分光光度计中， 两个波长的吸光度几乎 同时测量，可测定背景 很强的混浊样品
多通道紫外可见分光光度计
使用光二极管阵列检测器，包含几百或上千个 检测元件同时测量不同波长处的光强，可的吸 收光谱。光谱信噪比优于传统扫描型仪器。
* n吸收带（弱） * 吸收带（强） 分子中电子离域程度高，结构刚性，取代基 为给电子取代基一般可以提高分子的发射。
结构刚性效应
取代基效应
有机化合物的外层轨道
紫外可见分光光度法
紫外吸收光谱法主要用于有机化合物的定性分 析和定量分析（通常是对纯物质的测定，如对 样品进行色谱分离之后检测；也可以用多波长 法进行两个或三个组分的检测）
激发态分子经过系间跨跃到达激发三重态后， 并经过迅速的振动弛豫到达第一激发三重态(T1) 的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返 回基态．此过程称为磷光发射。
磷光发射是不同多重态之间的跃迁．(即T1-S0) 故属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光 要长得多，约为10-3到10s。所以，将激发光从 磷光样品移走后，还常可观察到后发光现象， 而荧光发射却观察不到该现象。
特别是用于动态分析，在线分析，过程分析
有机化合物的定性分析
生色团的分析：紫外吸收光谱相同，不 能保证是同一化合物
分子发光光谱法
由于物理主义的进步，人们发现分子发光光谱的重要性，它的应用也
越来越普遍。
分子发光光谱是一种用来测量分子光学性质的技术。
它
通过测量发光分子的光谱图，可以获得更多完整且准确的信息，而这
些信息有助于揭示分子结构与性质的关系。
分子发光光谱是一种活性技术，它利用光谱来了解化学反应物的结构。
这项技术利用发出的光的频率和强度来分析分子，由于分子的结构它
们发出的光每个都有不同的频率和强度。
另外，分子发光光谱还能够
反映分子间的相互作用，从而在实验室中观察分子间的相互作用。
分子发光光谱法在科学研究中也得到广泛应用，它被用来研究分子的
结构、反应机理、生物活性及其过程，广泛应用于有机合成、药物研
究及生物化学等领域。
它已经成为结构和生物活性异质性测定的重要
手段，其应用范围也得到了显著的扩展。
例如，分子发光光谱被用来
研究有机和无机分子的生物活性和结构特征，以及有机分子間的相互
作用。
它还可以用来分析酶的结构和功能，从而帮助人们了解酶的作
用机制，还可以检测药物的生物学活性和结构。
未来，分子发光光谱将继续在科学研究中得到广泛应用，将在许多实
际领域，如医学、农业等方面发挥重要作用。
它将为人们提供更多关
于分子结构和性质的信息，从而有助于更深入地探索分子的特性和机制。
《分子发光光谱法》课件
分子对光的吸收具有选择性，激发光谱和发射光谱是荧光物 质的基本特征。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
《仪器分析实验》分子荧光分析法
标示量 的百分数
西北大学基础化学实验
jkzq!0&G%A7MhAj3XCnPBAigZ1iUUR7CjPlKDa+ kbJ9fv3(tCBZ% hT mEM k3b!L)YX9hQ*izToSTQ!Wo*alD75dez+Bdml xHtp7*rJEciGl01S%j0dXj xs6WxxD0C W wW%cO)H C5q%FZG2q-YcX)4afp2%(R dD$)YA%lA1#Mfvdn( 13JQqKdRIV8io3#VpNVNr w5QD v0J7ir3N d$oj vjr 1x&UKa))-uQUN7I#LsTgij WIo9wyYQpJSVECg4bTN4+ b3 v36GYph9+ ef9OBPTGSG7JOUU F kbYPHh2XgI*OC64%)rQQuOIlqpf$6Etc x5wMAx-DQ6&b+6TACIMBfKNY7i %bm8) xjfyDObYnQ)Z aPffM HEKvkqSUsH hEqPOvYJLw5*Loc4T Ih1x7eiaApMW5%9%fqKuDoL&)(LgWObFPVQ8HT GGN w&3F Wd*a9R2$KEi*euIQ*Z+z hf#43jnPxyRR rAUI$30wA&SfLdFLbQ-UK8$9g$NLe-BGH58bXo1yXOk-ek)BU A*9pN uTNRH tFoV0qKlM!lkrfgh+dQaFtSU 3&r* m-7fv!GKoU9Ls E53b6Q* xW*q-2gxdD vLtqqWPF+r SIT$%T f1zGla63m-2o5MB$xAOpdWrZ!59Z8GDz zZhAlFq+h&ILCMu2zXYPmf!8+IYXVaTbrI9TE
西北大学基础化学实验
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仪器分析课件 荧光一
φf=0.75
1-二甲胺基-8磺酸盐 φf=0.03
H C=C H
H C=C
H
反式二苯乙烯 有强荧光
顺式二苯乙烯 无强荧光
4.取代基
（1）对共轭体系作用大的给电子基 团，增加共轭效应，使荧光效率增 强，荧光波长长移。 例：-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR2等 饱和杂原子基团。
（2）对共轭体系作用大的吸电子基 团，减弱 π 电子共轭性，使荧光 减弱甚至熄灭。
电子处于激发态是不稳定状态，返回基 态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等 方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越
内转移
外转移
振动弛预
• 振动弛豫：从同一电子能级的各较高振 动能级逐步返回到最低振动能级。
• 内部能量转换：两个电子能级之间的能
量转换。 • 外部能量转换：激发态分子与溶剂分子 或其它荣指分子相互作用及能量转移。 • 体系间跨越：指不同多线态间的无辐射 跃迁。
的关系曲线。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的 分子最多，荧光强度最大；
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波
长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射
光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发
射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消
V4 V3 V2 V1 V0
(e)体系间跨越
(b)
V4 V3 V2 V1 V0
T1
第一激 发 态 三线态
λ1
基 态S 0 (a)吸收
λ′
V4 V3 V2 V1
1-二甲胺基-8磺酸盐 φf=0.03
H C=C H
H C=C
H
反式二苯乙烯 有强荧光
顺式二苯乙烯 无强荧光
4.取代基
（1）对共轭体系作用大的给电子基 团，增加共轭效应，使荧光效率增 强，荧光波长长移。 例：-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR2等 饱和杂原子基团。
（2）对共轭体系作用大的吸电子基 团，减弱 π 电子共轭性，使荧光 减弱甚至熄灭。
电子处于激发态是不稳定状态，返回基 态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等 方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越
内转移
外转移
振动弛预
• 振动弛豫：从同一电子能级的各较高振 动能级逐步返回到最低振动能级。
• 内部能量转换：两个电子能级之间的能
量转换。 • 外部能量转换：激发态分子与溶剂分子 或其它荣指分子相互作用及能量转移。 • 体系间跨越：指不同多线态间的无辐射 跃迁。
的关系曲线。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的 分子最多，荧光强度最大；
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波
长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射
光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发
射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消
V4 V3 V2 V1 V0
(e)体系间跨越
(b)
V4 V3 V2 V1 V0
T1
第一激 发 态 三线态
λ1
基 态S 0 (a)吸收
λ′
V4 V3 V2 V1
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
第14章 分子发光光谱法_2016
吸收光谱的形状决定于第一电 子激发态中各振动能层的分布情况。 荧光光谱的形状决定于基态中 各振动能层的分布情况。 基态中振动能层的分布和第一 电子激发态中振动能层的分布情况 是类似的, 因此荧光光谱的形状和 吸收光谱的形状极为相似。
24 3 2 1 0
S1
3 2 1 0
S0
25
14.1.5 影响荧光强度的因素
发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重度的电子能级中，等能级间的无辐射能级交 换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单
重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移 能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，
8
Blue fluorescence of an aqueous extract of narra excited by a 400-nm UV LED in room light. A standard 1-cm cuvette is shown on the left. On the right, the beaker is viewed from above and sits partially over a white surface to show the yellow appearance of the solution. The beaker contains a solution made with one wood shaving of narra shown.
化合物 苯 萘 蒽 丁 省 戊 省
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
0.11
205 278
24 3 2 1 0
S1
3 2 1 0
S0
25
14.1.5 影响荧光强度的因素
发生振动弛豫的时间10 -12 s。
内转换：相同多重度的电子能级中，等能级间的无辐射能级交 换。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单
重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移 能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，
8
Blue fluorescence of an aqueous extract of narra excited by a 400-nm UV LED in room light. A standard 1-cm cuvette is shown on the left. On the right, the beaker is viewed from above and sits partially over a white surface to show the yellow appearance of the solution. The beaker contains a solution made with one wood shaving of narra shown.
化合物 苯 萘 蒽 丁 省 戊 省
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
0.11
205 278
答案_分子发光光谱法
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仪器分析
3. 荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其他溶质分子之 间相互作用，使荧光强度减弱的作用。 ）： 7. 以下六种方法均能改变荧光量子效率（ 增大。这是由于当 1）降低温度。温度降低， 温度降低时，介质的黏度增大，溶剂的弛豫作 用减小。 减小。这是由于温 2）升高温度。温度升高， 度升高时，碰撞频率增加，使外转换的去激发 概率增加。
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减小。 3）改变荧光体的浓度。荧光体浓度较大时， 这是由于浓度较大时，激发态荧光分子与基态荧光 分子之间产生碰撞或能量转移。 4）加入静态猝灭剂。静态猝灭剂是荧光分子与猝灭 剂形成不发光的基态配合物而使荧光猝灭，加入静 态猝灭剂导致 减小。 5）加入动态猝灭剂。基态， 减小。 6）改变溶剂的黏度。溶剂的黏度减小，弛豫作用减 小， 减小。
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分子发光光谱法
P328 1. 量子效率：发荧光的分子数与总的激发态的 分 子数之比。 振动弛豫：同一电子能级内，以热能量交换形 式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。 系间跨越：不同多重态间的一种无辐射跃迁。
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仪器分析
2. 荧光、磷光的异同点： 相同点：同属于光致分子发光现象，分子吸收的是紫 外可见UV-Vis光的能量。 不同点：荧光指电子从第一激发单重态返回到基态时 释放的光；磷光是指电子从第一激发单重态，经系间 跨越至第一激发三重态，然后返回到基态释放的光。
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
《仪器分析》教案5-分子发光分析法
《仪器分析》教案5-分子发光分析法第一篇：《仪器分析》教案5- 分子发光分析法第8章分子发光分析法8．1教学建议一、从光谱定性分析和定量分析的依据和方法入手，在了解分子发光分析特点的基础上，介绍分子荧光与磷光光谱分析法的基本原理、仪器结构组成、常规测定方法及应用。
二、在比较分子荧光与磷光光谱分析法的基础上，介绍化学发光分析方法的基本原理及分析特点与应用。
8．2主要概念一、教学要求：（一）、掌握分子荧光与磷光光谱分析方法的基本原理；（二）、掌握荧光与磷光分析仪器的结构组成、常规测定方法及应用；（三）、掌握化学发光法的基本原理及应用；二、内容要点精讲第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
荧光分析的特点：灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001mg/mL之间。
可见比UV-Vis的灵敏度高得多。
选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。
结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。
应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。
二、基本原理1、分子荧光的产生处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。
这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。
单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s;而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4~1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫(VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。
分子发光光谱法资料
（b）减弱荧光的取代基 ——-COOH 、 -NO2 、-
COOR 、-NO、-SH 吸电子基团, 使荧光波长蓝移， 荧光强度减弱
芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间跨跃加强，磷 光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而 减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
温度对磷光影响更大
3. pH的影响
大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧 光性质受溶液pH的影响很大
共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具 有各自的荧光效率和荧光波长
例： 苯酚
_
OH
O
_
OH
H+
pH≈1有 pH≈13
荧光
无荧光
离子化后， 荧光消失
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或 痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If 反而降低，有时发生荧光猝灭效应。
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、 液槽、检测器和显示器组成
光源
I0
I
第一单色器
液池
吸收检测器
l ex
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光
强度，可提高荧光强度。
仪器分析分子发光课件
分子发光仪器分析的应用
环境监测
利用分子发光仪器分析技术检测水体、大气等环境中的有害物质，如 重金属离子、有机污染物等。
生物医学研究
利用分子发光仪器分析技术检测生物体内的生物分子、细胞等，如 DNA、蛋白质等，为疾病诊断和治疗提供依据。
食品安全检测
利用分子发光仪器分析技术检测食品中的有害物质，如农药残留、添 加剂等。
化学分析
利用分子发光仪器分析技术对化学物质进行定性和定量分析，如无机 物、有机物等。
04
分子发光仪器分析技术的前景
分子发光仪器分析技术的发展趋势
01
02
03
自动化与智能化
随着技术的进步，分子发 光仪器分析将更加自动化 和智能化，提高分析速度 和准确性。
高通量与高灵敏度
发展高通量和高灵敏度的 分子发光仪器，满足大规 模和复杂样品的分析需求 。
分子发光仪器分析的分类
荧光光谱法
利用荧光物质在特定波长光激发 下发出特定波长的荧光，通过对 荧光光谱的分析，实现对物质成
分和结构的分析。
化学发光法
某些化学反应能够释放出特定波长 的光子，通过对化学发光光谱的分 析，实现对物质成分和结构的分析 。
生物发光法
某些生物体能够发出特定波长的光 子，通过对生物发光光谱的分析， 实现对生物体成分和生理状态的分 析。
食品安全领域
用于食品成分分析、添加 剂检测以及农药残留检测 等，保障食品安全。
分子发光仪器分析技术的挑战与机遇
挑战
高灵敏度与特异性、复杂样品处 理、仪器小型化与便携化等。
机遇
随着新材料的发现、纳米技术的 应用以及跨学科的交叉融合，分 子发光仪器分析技术将迎来更广 阔的发展空间和应用前景。
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2 分子荧光光谱仪
入射狭缝 光源 出射狭缝 激发 单色器 样品池
入射狭缝
发射 单色器
放大器
信号输 出装置
出射狭缝 检测器
光源－氙灯和高压汞灯、激光器 单色器－激发单色器和发射单色器
样品池－四面透光的方形石英池
检测器－光电倍增管、电荷偶合元件检测器可
一次获得荧光二维光谱
3 分子荧光光谱的应用
的荧光强度－发射波长的关系曲线，反映了在某一
固定激发波长下，不同波长处分子的相对发射强度。 荧光光谱用于进行荧光测定时选择恰当的测定波长 或滤光片。
同步荧光光谱－同时扫描激发和发射单色器波长的 条件下，测绘光谱图，所得荧光强度-激发波长（或 发射波长）曲线为同步荧光光谱。
① 固定波长同步扫描荧光法：= em -ex不变
但是也有相反的情况，例如苯胺萘磺酸一类的化合物在 戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五种不同的醇溶液中，
随着溶剂极性增大，荧光效率减小。
由此可见，荧光峰的位臵和强度与溶剂的关系，规 律性不强，必须具体分子具体分析。
菲绕啉在联二苯中不同温度时的荧光光谱
荧 光 强 度
较高的温度 下，热运动 加快，溶质 分子与溶剂 分子之间的 碰撞机会增 大，荧光效 率下降。
定
4 磷光光谱法
激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，发生
导致荧光减弱，称为内滤（自吸是一种内滤）
2-苯胺-6-萘磺酸的荧光发射光谱 A 乙腈 B 乙二醇 C 30%乙醇-水 D 水
8－羟基喹啉在不同溶剂中的荧光表现
溶剂 介电常数 荧光峰/nm 荧光效率
四氯化碳 氯仿 丙酮 乙腈
2.24 5.2 21.5 38.8
390 398 405 410
0.002 0.041 0.055 0.064
与浓度的线性关系将出现偏离。
单组分直接测定
单组分间接测定
化学反应转化为荧光分子
荧光猝灭法 多组分的荧光测定 荧光峰不重叠，选不同的发射波长；激发光谱 明显不同，荧光峰重叠，可选用不同的激发波长
无机物分析：无机阳离子本身不发荧光，可与一些有
机试剂形成荧光配合物，可以测定的元素已达60多种
荧光光谱的特征 斯托克斯（Stokes）位移： 在溶液中，荧光发射波长总
是比其相应的吸收（激发）光谱的波长长，该现象是1852年
由Stokes发现，因此称为Stokes位移。这种位移反映了荧光 激发与发射间产生的能量损失（来源于振动驰豫和溶剂的分 子的驰豫作用）。
镜像对称规则：吸收光谱形状表明了第一激发态的振动能
磷光 4
对于大多数有机物分子，其电子数为偶数，净自 旋之和为S＝0，即基态分子为单重态（M＝ 2S+1=1）。 分子处于激发态时，某个电子可能会改变自旋方 向，即自旋平行，此时S＝1/2+1/2=1，分子处于这样 的激发态为三重态，以T表示。由于自旋平行比自旋 配对的状态更稳定，因此三重态能级比单重态略低。 根据光谱选律，分子直接被激发到三重态T1 的概 率比较小，因为是S0－T1禁阻跃迁。
磷光的寿命比荧光长得多，约为10-3s~10s。
由于分子结构和所处环境不同，各去激发过
程的速率不同。如荧光发射过程较其它过程快，
则可观察到荧光现象。
荧光的量子效率 发荧光的分子数与总的激发态分子数之比
发射的光子数 吸收的光子数
K f Ki
Kf
Kf荧光发射过程速率常数，主要取决于分子结构；
对于很稀的溶液，即bc 0.05，此时上面的式
子中第二项以后的各项可以忽略不计，即 1－e-2.303bc＝ 2.303bc If＝ Ia＝ I0 2.303bc 因此，当激发光强度一定，并且溶液浓度较小时， 荧光强度与荧光物质浓度之间成正比： If ＝Kc
对于较浓的溶液，其吸光度大于0.05时，荧光强度
溶液单分子行为研究：罗丹明6G标记DNA 基因研究与检测：DNA与小分子的相互作用等 生物化学和生理医学： 能测定微量氨基酸和蛋白质，
还能研究蛋白质的结构，酶以及酶动力学和机理，细胞新 陈代谢等
药物分析：分析低浓度的药物，6－巯基嘌呤是急性白
血病的重要药剂，相关分析方法还较少。用高锰酸钾将6－ 巯基嘌呤氧化形成嘌呤－6－磺酸盐，即可用荧光法进行测
拉曼散射光－和瑞利散射有关的另一种形式的散射光。它
是由分子吸收了频率较低的光上升到基态中较高的振动能级 后，返回到稍高于或稍低于原来的能级时发射的光，其波长
较激发光波长稍长或者稍短。一般说来，拉曼散射光比瑞利 散射光弱。
荧 硫酸奎宁水溶液 光 强 在320nm光激发 度 下荧光光谱中的 各类型散射峰
跃迁类型：*→量子效率高，因为跃迁摩尔吸光系数 大100-1000倍，跃迁寿命短（10-7~10-9s），n→*（107~10-9s），其次，系间跨越速率常数小
共轭效应：稠环化合物一般发强荧光 取 代 基 效 应 ： 给 电 子 基 团 （ -NH2, -OH, -OCH3, -
450
360 320
320nm是一级瑞利散射光， 640nm是二级瑞利散射光， 450nm为荧光峰，360nm 为水的一级拉曼光，720nm 为水的二级拉曼光。
640
720
（nm） 除了荧光峰之外，都会在空白试验中出现。因此，当荧光物 质的荧光峰与激发光波长靠近甚至重叠时，散射光会严重影 响方法的灵敏度，应设法减小或消除此影响。在测定前，先 测空白溶液的发射光谱，然后选择合适的激发波长。溶剂的 散射光随激发波长变化而变化，而荧光峰与激发波长无关， 这样通过改变激发波长即可消除散射的影响。
分子发光光谱法
基本要求： 1. 理解分子荧光和分子磷光的基本原理 2. 理解分子荧光激发光谱、发射光谱、同步光谱
和三维荧光光谱的含义
3. 掌握分子荧光发射光谱的特性
4. 了解荧光光谱仪的组成和各部分作用
5. 掌握荧光分析法和磷光分析法的主要应用范围
ห้องสมุดไป่ตู้
6. 了解化学发光分析法的原理和应用
分子发光光谱法包括： 光致发光
级结构，荧光光谱形状取决于基态中各振动能级的分布情况。 一般基态中振动能级与第一激发态振动能级分布是类似的，
因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。
苝的苯溶液的荧光光谱和吸收光谱
荧光光谱的特征 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关：
荧光物质发射荧光的特性之一是不管引起物质分子激发
的波长是1还是2，荧光的波长都是3。
② 固定能量同步扫描荧光法：= (1/ex -1/em)不变
③ 可变波长同步扫描荧光法：两个单色器以不同的速率扫描
特点：光谱简化，谱带窄化，减小光谱重叠，减小 散射光的影响，选择性提高，但损失其他光谱带含 有的信息
并四苯的激 发光谱和发 射光谱（a）
同步荧光光 谱 =3nm （b）
分子的去激发过程
速率最快，激发态寿命最短的途径占优势。
振动驰豫－受激溶质分子向溶剂分子转移过剩
的能量，以10-13s~10-11s的极快速度
荧光发射－以10-9s~10-7s左右的短时间内发射光
量子回到基态的各振动能级
内部转换－激发能转化为热能。其速度取决于
此过程所包含的两个能态之间的相对能量差。 当两个电子能级非常靠近，以至其振动能级有 重叠时，内部转换十分容易发生。如两个单重 激发态或两个三重激发态的较低激发态的高振
这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激 发态的分子经振动驰豫即内转换等过程最终回到第一激发态
的最低振动能级上，而分子荧光的发射总是从该能级跃迁到 基态的各振动能级上，因此其形状与激发波长无关。
反映在光谱图上就是具有一个吸收带和两个吸收带的不 同物质，一般都发射一个荧光谱带（个别例外）。
影响荧光强度的因素 分子结构
三维荧光光谱－20世纪80年代发展起来，以荧光强 度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图，也 称为总发光光谱，等高线光谱等。 ① 三维曲线光谱图
② 平面显示的等强度线光谱图
特点：提高完整的光谱信息，可作为光谱指纹技术
用于环境检测和法庭试样的判证。
（a）蒽和萘的三维荧光光谱图 （b）8-羟基苯芘的等强度光谱图
-168º C -150º C
-78º C
24º C
NH3+
NH2
NH-
pH < 2 无荧光
7-12 蓝色荧光
pH > 13 无荧光
金属离子与有机试剂形成的荧光配合物，受pH 的影响更大。一方面影响配合物的稳定性，一方面
影响配合物的组成。
例如，镓离子与邻二羟基偶氮苯在pH3－4溶液中形成1：
1配合物，发荧光。在pH6－7溶液中则形成1：2配合物，不 发荧光（ 1：2 型平面结构不存在） 。
∑Ki 系间跨越、外转换等其他无辐射跃迁的速率常
数的总和，主要取决于环境。
荧光激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱－固定发射波长，扫描激发波长得到
的荧光强度－激发波长的关系曲线，反映了在某一
固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对 效率。激发光谱用于进行荧光测定时选择恰当的激 发波长。 荧光发射光谱－固定激发波长，扫描发射波长得到
动能级常常与较高激发态的低振动能级重叠，
重叠的地方两激发态能量一致，内部转换效率 很高，速率很快，一般只需要10-13s~10-11s的时 间。
外转换－激发态分子与溶剂和其它溶质分子之
间的相互作用即能量转换过程。它是荧光和磷 光的竞争过程，因此该过程使发光强度减弱甚 至消失，这种现象称为“淬灭”或“熄灭”。 体系间跨越跃迁－受激分子从激发单重态转至
灵敏度高，检测下限低0.1~0.001g/cm3 ，荧光分
析法的应用广泛，可测定60余种元素，尤其是生物