第五章分子发光分析

电子激发单重态与三重态示意图 在单重激发态中，电子的自旋方向仍然和处于基态轨道的电子 配对，表现出抗磁性，其平均寿命为10－5～10－8s； 在三重激发态中，两个电子平行自旋，表现出顺磁性，其平均 寿命为10－4～1s。
3、分子荧光（磷光）产生示意图 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级， 每个电子能级中又包含了一系列的振动能层和转动能层。图 中基态用S0 表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重 态分别用S1 、S2 表示，0、1、2、3⋯表示基态和激发态的振 动能层（见下图），第一、二电子的激发三重态分别用T1和 T2表示。
内转化 S2 3 2 1 V=0
振动弛豫
内转化 系间窜跃
１. 辐射跃迁的类型
荧光：10-8 sec 磷光：1~10-4 sec
T2
S1 能 量
吸 收 荧 光 T1 磷 光
２. 无辐射跃迁的类型 振动弛豫(VR) : 10-12sec
内转化(ic):S2～S1能级之
间有重叠 系间窜跃(isc): S1～T1能 级之间有重叠 3
对于稀溶液，当 bc<0.05（磷光 bc<0.01）时：
(2.303εbC )2 (2.303εbC )3 (2.303εbC )4 I f I 0 (2.303εbC ) 2! 3! 4!
I f 2.303k f I 0 ε b C
If----荧光强度
光源 激发单色器 氙 灯 样品池
光电倍增管
光源
激发 单色器
I0
I
样品池
数据处理 仪器控制
发射单色器
If
发射 单色器
பைடு நூலகம்
检测器
数据处理 仪器控制
（二）光源 1.对光源的要求 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命 常用：氙灯光源 高压汞光源
（三）单色器 荧光分光光度计一般采用两个光栅单色器，用来获得激发 光谱和荧光光谱。 （四）检测器 荧光强度一般较弱，要求检测器具有较高的灵敏度。荧光 分光光度计采用光电倍增管作为检测器。
5-5
式5－5为荧光（磷光）定量分析的基本依据，若以荧光强度
对荧光物质的浓度作图，在较低的浓度下，呈现良好的线性 关系，当浓度较高时，其线性关系将发生偏离，其原因除了
在上式中作的近似计算外，还存在猝灭效应。
荧光的猝灭：荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间 相互作用导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。 猝灭剂：与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下 降的物质。
室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。处于基 态的分子吸收能量后被激发为激发态。激发态不稳定，将很 快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现 象被称为“发光”。 2、激发单重态S与激发三重态T 处于分子基态单重态的一个电子被激发时，通常跃迁至 第一激发单重态的能级轨道上，也可能跃迁至能级更高的单 重态上，这种跃迁是符合光谱选律。如果跃迁至第一激发三 重态轨道上，则属于禁阻跃迁。
发出荧光的分子数 f 激发态分子总数
荧光效率越高，辐射跃迁概率越大，物质发射的荧光也 就越强。若以各种跃迁的速率常数来表示，则 Kf f n K f Ki i 1 Kf－荧光发射过程的速率常数，取决于物质的化学结构 K －非辐射跃迁速率常数之和，取决于化学环境和化学结构
n i 1 i
5.1 荧光分析法
一、概述
早在16世纪，人们就观察到当UV－vis照射某些物质时，这些物 质就会发出各种颜色和不同强度的光，停止照射时，物质的发 光随之消失。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种 现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是
2、荧光与分子结构关系
（1）跃迁的类型
π * →π
π*→ n
平均寿命10-5~10-7sec 平均寿命10-7~10-9sec
对于有机荧光物质:
n →π* εmax＜ 100 π→π* εmax≥104
π *→π 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。
（2）强荧光的有机化合物具备下特征： ①具有大的共轭π键结构：共轭体系越大，π电子离域性 越强，越易被激发而产生荧光，且随共轭体系的增大，荧光 效率提高，荧光峰向长波方向移动，如下表所示：
（三） 分子荧光(磷光)强度与物质浓度的关系
1. 荧光(磷光)强度与浓度的关系
光吸收定律（Lambert – Beer Law）
相应的吸光分数为：
It A lg T lg bC , T e 2.303 bC I0
It 1 1 T 1 e 2 .303ε bC I0
O
NO2
不产生荧光、弱磷光 弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
3、影响荧光强度的外界因素 （1）温度：大多数分子在温度升高时，分子与分子之间， 分子与溶剂分子之间的碰撞频率升高，非辐射能量转移过程 升高，荧光效率降低，因此，降低温度，有利于提高荧光效 率 。由于三重态的寿命比单重态寿命更长，温度对磷光影响 比荧光更大。
2 1 V=0
S0
l1
l2
l3
l
, 3
分子内的光物理过程
4、常用术语 （1）振动弛豫：在同一电子能级上，分子由较高振动能 级向该电子态的最低振动能级的非辐射跃迁，其过程速率极 大，在10－14～10－12内即可完成。 （2）内转化：相同多重态的两个电子态之间（如S2 S1） 的非辐射跃迁，其转化速率取决于两能级之间的能量差，相 邻单重激发态之间能级较近，其振动能级常发生重叠，内转 化很快。 在通常情况下，分子被激发到任一个电子激发态，经内 转化和振动弛豫都会跃迁至最低电子激发态的最低振动能级 上，而且时间极短(10－13~10－11)。
由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，
他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用
铝—桑色素配合物的荧光对铝的含量进行测定。
20世纪以后，随着荧光仪器的问世，荧光分析方法得到极大的 发展，现已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
化合物
f
0.11
0.29
0.46
0.60
②具有刚性的平面结构：分子的刚性平面结构有利于荧 光的产生，是因为刚性平面结构可以减少分子振动和碰撞去 活的可能性，即使得外转移能量损失减少，有利于荧光产生 。如：
芴
联苯
f=1
f=0.2
③取代基效应
a.给电子取代基加强荧光：产生 p →π共轭，可使共轭 体系增大，导致荧光增强。
第五章 分子发光分 析法
5.1 荧光分析法
5.2 磷光分析法
5.3 化学发光分析法
首先我们来了解以下几个重要概念： 一、分子发光（Molecular Luminescence）：基态分子 吸收了一定能量后，跃迁至激发态，而激发态分子以辐 射跃迁形式将其能量释放返回基态时，产生分子发光。 二、分子发光的类型： 1.按激发的模式分类 光致发光 化学发光/生物发光 热致发光 场致发光 摩擦发光
如表5-1总结了光致发光的主要过程： 表5-1 光致发光的主要过程
过程 吸收
表示式 S0+hv S2(S1)
内转化/振动弛豫
荧光
S2
S1
S1
S0+hvf
体系间窜跃
磷光
S1
T1
T1
S0+hvp
（二）荧光效率及其影响因素 1、荧光效率（ f ）
又称为荧光量子产率，它是用来描述辐射跃迁概率的大 小，其定义：
固定lem=620nm(MAX)
lex =290nm (MAX)
荧光分析法其特点： 1.灵敏度高；检测限比吸收光谱法低1-3个数量级，通常在 ppb级。 2.取样量少，操作简单。 3.选择性比吸收光谱法好，能产生紫外-可见吸收的分子不一 定发射荧光或磷光。 荧光分析法的应用：
在药物、临床、环境、食品的微量和痕量分析以及生命 科学研究各个领域都具有重要的意义。
二、基本原理 （一）分子荧光的产生 1、分子发光
自猝灭效应：由荧光物质自身引起的荧光强度减弱的现象 称为荧光的自猝灭效应。经常遇到的有两种：
一种是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基 态分子所吸收，基自吸收。
另一种是由于激发分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率 的增大，荧光效率降低。
三、荧光分析仪器 （一）主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
（五）荧光的激发光谱
荧光激发光谱：将待观测的发射波长（发射单色器） 固定，然后改变激发光波波长（激发单色器），根据所测荧 光强度与激发光波长的关系得到激发光谱曲线。如下图所 IF4800 示：
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
思考：酸和碱的定义
（2）溶液的 pH：带有酸性或碱性环状取代基的芳香族化 合物的荧光一般都与 pH 有关，有些化合物在离子状态时不 显荧光。为此，在用荧光强度进行定量测定时，严格控制溶 液 pH是非常重要的。 （3）溶剂：溶剂的极性增大，对激发态会产生更大的稳 定作用，致使激发态的能量降低，由此由激发态向基态的跃 迁能量降低，是物质的荧光波长红移，荧光强度增大。
—NH2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN 化合物
相对荧光强度
苯 10
苯酚 18
苯胺 20
苯基氰 20
苯甲醚 20
λ emmax (nm) 278~310 285~365 310~405 280~390 285~345