第五章分子发光分析法
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该发光反应速度慢,某些金属离子可催化反应;利用这 一现象可测定这些金属离子。 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程:
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5. 化学与生物发光分析的应用
(1) 该发光反应速度慢,某些金属离子可催化反应;利用 这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+ 、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等
2021/2/7
生物发光分析应用 1
在pH 7~8;荧光素酶(E)和Mg2+的存在下,荧光素
(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应,生成磷酸腺甙(AMP)荧光 素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi):
ATP
+
LH2Leabharlann Baidu
+
E
+
Mg2+
pH7 - 8
AMP·LH2
·E
+Mg
ppi
+
2H+
复合物与氧反应,产生化学发光:
(2) 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2; (3) 间接测定某些生物试样
氨基酸 +
氨基酸氧化酶
O2
酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖氧化酶
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2
通过测定生成的H2O2 ,确定氨基酸、葡萄糖含量。
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草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接 受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系,可发出很强的可见光 ,发光效率高,使用不同的稠环芳烃,发射出不同颜色的光( 冷光源)。
c. 乙烯与O3的发光反应
乙烯与O3反应,生成激发态乙醛:
CH2O* → CH2O + h 最大发射波长:435nm;对O3的特效反应;线性响应 范围1 ng/cm-3 ~1g/cm-3;
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(2)火焰中的化学发光反应
在富氢火焰中,也存在着很强的化学发光反应; a. 一氧化氮
SO2 + 2H2 → S + 2H2O S + S → 2S2 * S2 * → S2 + h 发射光谱范围:350~460nm; 最大发射波长:394nm; 灵敏度: 0.2 ng/cm-3; 发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。
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(3)液相中的化学发光反应
Cu、机M理n研、究Co较、多V、,F在e、分C析r、中C应e用、最Hg多、;Th可等测。痕量的H2O2 、 应用最多的发光试剂:鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼); 化学发光反应效率:0.15~0. 05; 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程:
NO + H → HNO* HNO * → HNO + h 发射光谱范围:660~770nm; 最大发射波长:690nm; 在富氢火焰中: NO2 + 2H → NO + H2O 该反应十分迅速;
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b.硫化物
挥发性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富 氢火焰中燃烧,产生很强的化学发光(蓝色):
NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2
黄素酶
FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h 最大发射波长495 nm;
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二、特点 characteristics
1. 灵敏度极高
例:荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析,可测 定210-17。Mol/L的ATP,即可检测出一个细菌中的ATP含量
装置流程:
发光反应室
光检测器
信号放大器
显示与记录
发光反应可采用静态或流动注射的方式进行: 静态方式:用注射器分别将试剂加入到反应器中混合, 测最大光强度或总发光量;试样量小,重复性差; 流动注射方式:用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器, 定时通过测量室,连续发光,测定光强度;试样量大;
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2. 仪器设备简单
不需要光源、单色器和背景校正;
3. 发射光强度测量无干扰
无背景光、散射光等干扰;
4. 线性范围宽 5. 分析速度快
缺点:可供发光用的试剂少;发光反应效率低(大大低于生 物体中的发光);机理研究少。
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三、装置与技术
instrument and technology
AMP·LH2 ·E + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]* 氧化荧光素 + h
最大发射波长562nm;
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生物发光分析应用 2
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用 下,在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下,发生发光反应 :
NADH脱氢酶