第2章 1生化实验中的缓冲液

• 配制常用的缓冲液的方法有两种：
• ①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制
0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列
体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常 用另一种方法； • ②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris 碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加
• （四）硼酸盐缓冲液
• 常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱
性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使
用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物， 尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓 冲液受到干扰。 • • （五）氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如 最常用的有：
精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达 0.005pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。 pH计测定pH值时会有几方面的误差： ⑴ 钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和H+ 都 非常敏感，尤其是高pH值的碱性溶液，Na+ 的干扰更 加明显。 ⑵ 浓度效应： 溶液的pH值与溶液中缓冲离子浓 度和其他盐离子浓度有关，因为溶液pH值取决于溶液 中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离 子的活度才与其浓度相等。稀释后仍需对其pH进行调 整。 ⑶ 温度效应：有的缓冲液的pH值受温度影响很 大，如“Tris”缓冲液，因而配制和使用都要在同一 温度下进行。
谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的 活性。
为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境， 就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同 的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定， 也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究
工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种
• (二) Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris (hydroxymethyl)
aminomethane）缓冲液
• Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有
超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶
电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 • Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围， • 例如： • Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0
•
•
甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0，
甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，
•
甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲
液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极
缓冲液），
• 组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5，
• 甘氨酰胺缓冲液：pH=7.8～8.8， • 甘氨酰甘氨酸缓冲液：pH=8.0～9.0。
生化实验中的缓冲液
缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化 学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内 进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，
而且受到[H+]的严格调控，能够做到这一点是因为生物体
内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动
需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代
pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。
• 有机酸缓冲液的缺点是： • ①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反
应过程可能发生干扰作用；
• ②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、
Zn2+、Mg2+等）结合而使缓冲液受到干扰；
• ③这类缓冲液易与Ca2+离子结合，所以样品中有Ca2+离 子时，不能用这类缓冲液。
• ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以
要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。
• （三） 有机酸缓冲液
•
这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，
pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、
乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。
• 甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用 后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬 酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值： pKa1＝3.10，pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二个
• ⑦ 该缓冲剂化学稳定； • ⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小；
• ⑨ 易制得高纯度的盐。
• 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂
来配制所需的缓冲溶液。
人体体液的pH值：
体液 血清 成人胃液 唾液 胰液 pH 7.35～7.45 0.9～1.5 6.3～7.1 7.5～8.0 体液 大肠液 泪 尿 脑脊液 pH 8.3～8.0 6.6～6.9 4.8～7.5 7.35～7.45
冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的
方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系， 这些缓冲体系应具有特有的要求和特性。他们合成的一 系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。
• Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学
反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专
门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶 的研究工作。 • 其缺点是： • ①价格昂贵， • ②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用， 因为它们会使空白管的颜色加深。
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Good’s缓冲液的配制
(七) pwk.baidu.com值的测定
测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法 是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。 广泛pH试纸的变色范围是pH=1-14、9-14等，只能粗略 确定溶液的pH值。 精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范 围是2-3个pH单位，例如有pH=1.4-3.0、5.4-7.0、9.5-13.0 等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。 测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸， 用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照， 估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染 样品溶液。
• ①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十
倍，pH值的变化大于0.1；
• ②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，
即：△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝
8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进 行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～ 4℃; • ③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封;
• 此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提
供更接近的天然环境。 • 其缺点是： • ①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生 物化学反应过程，如代谢过程等。 • ②试剂的价格较高。
• （六）两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又
称Good’s缓冲液
• 1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓
（一）磷酸盐缓冲液
• 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，
由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制
的缓冲液，pH范围最宽：
•
• • • •
NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21
Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4， 配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。
缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，
精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。
适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：
• ① pKa值在6～8之间；
• ② 在水中的溶解度高；
• ③ 不易穿透生物膜；
• ④ 盐效应小；
• ⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；
• ⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀；
• 其缺点为：
• ①易与常见的钙Ca2+离子、镁Mg2+离子以及重金属离子
缔合生成沉淀；
• ②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用
会产生某种程度的抑制作用。 • 应用： • 1、PB缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4; • 2、PBS缓冲液：Na2HPO4-KH2PO4 , NaCl+KCl
4mol/L HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然
后再加水补足到1L。
• Tris-HCl缓冲液的优点是：
• ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体 系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液； • ②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金 属离子发生沉淀。 • 其缺点是：
• 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，
但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能
用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠
）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。
• 磷酸盐缓冲液的优点为：
• ①容易配制成各种浓度的缓冲液； • ②适用的pH范围宽； • ③pH受温度的影响小； • ④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小 于0.1。