转基因食品的定量PCR检测方法

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测定 )><95: 启动子的 +), 反应 为避免操作
误差， 每个样品 +), 实验重复三次， 所用的 -./ 模板量 为 #5 ? !"@A 。 检测的 95:)>< 启动子的引物为 0)1))
-./ 浓度调整到与含 #B 转基因成份的参考样相当。
通过凝胶成像分析系统对琼脂糖凝胶电泳的结果 进行分析， 得到每条带的相对浓度， 以此数据作 ‘ 目标 — 目标 -./ 浓度 4 竞争 -./ 浓度 ’ 的对 -./ 浓度—— 数图， 线性回归分析后得出工作曲线如图 !。
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前言 随着现代生物技术的发展， 转基因食品已逐步进入
普通百姓的生活。 由于转基因食品所具有的潜在非安全 性，为保护广大消费者的权益，满足其选择权和知情权 以及出于国际贸易的需要， 转基因食品的检测越来越引 起各国政府和有关食品监督机构的重视。目前，基于
#O #
样品 234 的提取和定量 按常规的方法提取 234 后，取部分样品 234 在
增，保守序列是单拷贝的微卫星序列，其引物：玉米
+/888/+8/484/4/4/4/488/4 R R 48++4+/48
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!""# 年第五期食品科技
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样品 -./ 的提取和定量 按常规方法提取 -./， -./ 含量可用紫外分光光 度计测定。
+,- 特异 234 片段的定性 ./0 筛选方法已广泛应用 于 +,- ( +<=<>?@ABBC DEF?G?<F EH7A=?ID * 食品的检测，一
些国家将此作为本国有关食品法规的标准检测方法 。
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与已知含量的 ,AHQ<H 比较， 用 "O ;P 琼脂糖凝胶中电泳， 计算机凝胶成像分析系统处理结果，以确定所提取的
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,C>D * EFGC 定量 +), 法 此方法须设计一个内部探针，该探针包含 5H端荧
光报告因子和 9H端猝灭因子。 由于猝灭因 +), 反应前， 子与荧光报告因子的位置相近，使荧光受到抑制而检 测不到荧光信号。 随着 +), 反应从上游的 +), 引物开 始， 引物和标记探针与目标 -./ 分子中对应的互补序 列复性， 聚合酶与探针相遇， 利用其 5H核酸外切酶活性 使报告因子释放， 产生的荧光可被内设的激光器记录， 记录到的荧光强度可反映 +), 的产物量，从而实现实 时定量分析。 此方法需要专门的仪器， 如 +I /33DFCJ 7FKLMLECGL
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定量竞争 +), 法
先构建含有修饰过的内部标准 -./ 片断 & 竞争 -./ ’ ，与待测 -./ 进行共扩增，因竞争 -./ 片断和 待测 -./ 的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开， 并可进行定量分析 & 见图 # ’ 。
图! 定量竞争 +), 的工作曲线示意图
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待测样品的测定
将 5""@A 待测 -./ 与经过定量的竞争 -./ 共扩 增，凝胶电泳后经扫描分析得到两条带，得到 ‘ 目标 的比值， 依此数据在工作曲线图上求 -./ 4 竞争 -./’ 得待测样品的 0<= 含量。
1/)///10))/1)/ 4 4 0/1/01000/11010)01)/，
产物得到 #;523 的电泳带。 在对待测样品 +), 扩增的同 时， 进行空白对照、 "6 #B 、 "6 5B 、 #B 、 !B 、 5B 0<= 含量 的标准样的 +), 反应， 根据凝胶电泳的结果建立工作曲 线， 由工作曲线判定待测样品的 0<= 含量。
图# () * +), 原理示意图
公司的 / 7 8 +NFLG OO"" 检测仪， 实验中所需要的试剂 供应商有试剂盒提供。
注： 竞争 -./ 和目标 -./ 在同一个反应管中扩增， 竞争 -./ 由质粒组成， 其带有一 个改造 +), 扩增子。改造部份可以是如上述 -./ 插入序列， 或者是 -./ 缺失序列， 或者 是一个点突变。+), 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离， 扩增竞争 -./ 和目标 -./ 可以根 据其大小来区分。
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食品科技 !""# 年第五期
检测技术
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转基因食品的定量 ./0 检测方法
黄东东 王庆华 吕振岳 周达民 广州・:#"%#: * ( 广东省食品质量监督检测站
+<=<>?@ABBC ,EF?G?<F SEEF 1LA=>?>A>?M< 2<><@>?E= ,<>5EFI
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一般 )""D7 的玉米粉可提取 #!7 234。 234 量。例如， ./0 反应
但是， 随着各国有关 +,- 标签法的建立和不断完善， 对
收稿日期： !""# & "$ & !’ 作者简介： 黄东东 ( #’)# & * ， 男， 广东人， 博士， 从事转基因食品 检测研究工作。
#O !O # 样品 234 的质量分析 设计合适引物，对样 品 ( 如玉米和大豆 * 基因组中的保守序列进行 ./0 扩
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中图分类号： 89!") 文献标识码： 4 文章编号： #"": & ’’;’ ( !""# * ": & ""$% & "!
般 ./0 只用作转基因食品的定性筛选检测。针对所存 在的问题， 研究人员在实验设计中引入内部参照反应， 以消除检测时的干扰， 并与已知含量的系列 +,- 标准 样的 ./0 结果进行比较，从而可以半定量地检测待测 样品的 +,- 含量。
竞争 -./ 片段作为内部标准 -./， 此片段除含有转基 因成分外 & 如 95: 启动子、.=: 终止子 ’ ，还插入数十
23 的 -./ 序列 & 或缺失数十 23 的 -./ 序列 ’ 。 !6 9
标准工作曲线的建立 取定量模板 -./，所含 0<= 量分别为 " ? #""B 的系列参考样， 分别与一定量的竞争 -./ 在同一反应 体系进行 +), 扩增。特异转基因 -./ 与竞争 -./ 竞 争反应体系中的相同底物、 引物， +), 反应获得相差数 十 23 的两条凝胶电泳带， 两条带浓度随转基因成份含 量的不同而有差异。 当两条带浓度相等， 则说明此参考 样 0<= 浓度与竞争 -./ 浓度相等。通常实验时竞争
#6源自文库!6 !
建立内部参照反应体系
利用高纯度的
以相同的引物对其 378#!# 质粒 & 含两个 95 : 启动子 ’ ， 一为与常规 95 : 启动子一致 -./ 扩增可产生两条带， 的 #;523 带，另一为 5""23 带，是 -./ 链上两个 95: 启动子之间的序列扩增的产物。 将此质粒 -./ 与待测 样品 -./ 以同一对引物共扩增，分析扩增结果，有助 于减少实验中的误差， 得到可靠的半定量结果。例如， 非 0<= 样的 +), 结果无电泳带显示， 而非 0<= 样与 质粒 -./ 共扩增则显示 #;523 带和 5""23 的两条带， 从而消除假阴性现象的影响。
大豆 )1/0) 0/0)110)/1/111 ， +), 产物约 #$"23 ，
)01)/10)1/01) 4 4 10)/)01)///110)10， +), 产
物约 5""23，据此可确定获得纯化 -./ 的质量和模板 量， 同时判定 +), 反应抑制因素的影响。
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竞争 -./ 的构建 按常规分子生物学的方法，用基因重组技术构建