烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
3.烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
基金项目:河南省科技厅“烟草细胞和发状根培养中茄尼醇的合成研究”(524420033)项目和郑州大学青年骨干教师资助项目“烟草中萜烯类次生代谢物的合成研究”资助。
作者简介:岳彩鹏(1974-),女,博士,郑州大学讲师,主要从事烟草生理研究。
E 2mail:yuecai peng@zzu .edu .cn 收稿日期:2007-05-21责任编辑:董志坚 E 2mail:yckj2256@yahoo 电话:0371267672650烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立岳彩鹏,李 品,黄象男,朱大恒郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号 450001关键词:烟草;愈伤组织;悬浮培养;白肋烟;鄂烟1号摘要:以鄂烟1号无菌苗的叶为材料进行愈伤组织的诱导,筛选出生长培养基的最佳激素配比,初步建立了烟草细胞悬浮培养体系。
结果表明,愈伤组织诱导的最优基本培养基为MS 培养基,以MS +NAA 110mg /L +6-BA 0.5mg/L 为最佳配方;愈伤组织最佳生长培养基为MS +2,4-D 011mg/L +NAA 115mg/L +6-BA 013mg/L,愈伤组织培养第6天进入对数生长期,第14天干重增至最初干重的12.536倍,并以此配方建立了烟草细胞悬浮培养体系。
中图分类号:S572.01 文献标识码:B 文章编号:1002-0861(2007)10-0056-04Tobacco Ca llus I nducti on and Est ablish m en t of Cell Suspen si on Culture Syste m Y UE CA I 2PENG,L I P I N ,HUANG X I A NG 2NAN,and Z HU DA 2HENG B i oengineering Depart m ent,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China Keywords:T obacco;Callus;Sus pensi on culture;Burley t obacco;E ’yan 1Abstract:The callus inducti on was carried out with the leaves of asep tic seedling of t obacco E ’yan 1,and the op ti m al hor mone p r oporti on in culture medium was screened out,and the syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established p reli m inarily .The results showed thatMS was the op ti m al basic mediu m for callus inducti on,and the op ti m al f or mula was MS +NAA 1.0mg/L +62BA 0.5mg/L;while the op ti m al f or mula for culture mediu m of callus wasMS +2,42D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +62BA 0.3mg/L.On the 6th day of callus culturing,the l ogarith m gr owth peri od started;and on the 14th day,the dry weight increased t o 12.536ti m es of its initial dry weight .The syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established based on this f or mula . 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径[1]。
烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立分析
实验原理
分化了的植物叶片细胞往往具有全能性，因 此将烟草叶片从植株上分离后，给予一定的培养 条件，可以诱导叶片细胞脱分化，脱分化的细胞 不断分裂就形成愈伤组织，愈伤组织再在合适的 培养条件下又能够再分化形成完整植株，烟草愈 伤组织的再分化是以不定芽的方式，即愈伤组织 先形成不定芽，再由不定芽形成完整植株，从而 完成了再生体系的建立。
接种第一天
接种第二天，因为外植体细胞开始被诱导脱分化， 并不断分裂增殖，造成叶片中央与边缘的细胞分 裂不均匀，因此，叶片中央凸起。
接种第五天，脱分化细胞不断分裂增殖，形成愈伤组织， 表现为叶片边缘泛黄增脱分化细胞不断增值，愈伤组织 不断增厚，整个叶片都翘起，并且已经开始再 分化形成绿色生长点。
实验十
烟草愈伤组织的诱导及再生体系的建立
实验目的： 1.通过实验，掌握无菌操作方法，熟悉烟草愈伤组织 的诱导及再生体系的建立的整个过程。 2.学习再生体系的建立方法，为掌握其他植物的组织 培养奠定基础；同时为转基因技术提供一个平台。
再生体系的建立主要应用于以下几个方面： 1、用于验证植物细胞的全能性。 2、是植物基因工程的重要基础，外源基因 转入受体细胞，受体细胞通过脱分化形成愈伤组 织，愈伤组织通过再分化形成植株，从而获得转 基因植株。 3、也是植物快繁的一种方式，通过诱导愈 伤组织再分化，能够在短时间内形成大量的不定 芽或胚状体，从而获得大量的植株。
第九天（诱导生成愈伤组织）
接种第十九天，绿色生长点进一步发育形成了不定芽， 不定芽长度最长可达1 cm 。
第十九天（长出幼叶）
将不定芽在无菌条件下，从芽的基部切下，然后插入生根培养基 中（1/2 MS），诱导生根。
芽的生根情况
实验步骤 一）材料的消毒 ： 1）剪取生长健壮的叶片，最好带有叶柄。 2）将整个叶片（包括叶柄）全部浸入70％的乙醇中， 不断振荡30 s。 3）将乙醇倒掉，迅速加入0.1％ 的升汞，再将整个叶片 （包括叶柄）全部浸入0.1％ 的升汞中，不断振荡 10 min。 4）于工作台上用无菌镊子将上述叶片夹入无菌烧杯中， 同时将升汞倒入盛有硫化钠的桶里。 5）用无菌水冲洗上述叶片3－5遍，取出后用无菌滤纸 吸干，备用。
烟草光能兼养型愈伤组织的诱导和培养条件
ｉ ｃ ｅ ｓ ｇｙ ｔ ｒ ｒ ｅ ．Ｈｏ ｅ ｅ ， ｅ ｈ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｏ ｕ ｒ ｓ ｓｒ ｄ ｃ ｄ ｔ ｅｏ ． ％ ，ｉ ｅ ｓｌ ｕ ｅ ｒ ｗ ｎ ｒ ａ ｉ ｌ ｕ ｎ ｇｅ ｎ ｎ ｗ ｖ ｒ ｗｈ ｎ ｔｅ ｃ ｎ ｅ ｔ ｉ ｆｓ ｃ ｏ ｅ ｗａ ｅ ｕ ｅ ｏ ｂ ｌ ｗ １ ５ ａｏ ｔ ａ ｉ ｔ ｒ ｄ ｂ ｏ ｎ． ｙ ｎ
第 ３ 卷 第 ２期 １ ２１ ０ ２年 ６月
中南 民族大学学报 （自然科学版 ）
Ｊ ｕ ａ ｏ ｏ ｔ－ ｅ ｔ ｌ ｎｖｒｉ ｒ ａｉ ａｉｅ （ ａ． ｃ． ｄ ｉ ） ｏ ｒｌ ｆ ｕｈ Ｃ ｎｒ ｉ ｓ ｙｆ ｔ ｎ ｌｉｓ Ｎ ｔＳ ｉＥ ｉ ｏ ｎ Ｓ ａＵ ｅ ｔ ｏＮ ｏ ｔ ｔｎ
Ｉ ｄｕｃ ｉ ｎ ｆＰｈ ｔ ａ ｔ ｔ ｏ ｉ ｃ ｔ ｔｖ ｌｕｓ ｏ ｃ ｔａ ａ ｎ ｔｏ ｏ ｏ ｏ ｕ ｏ ｒ ｐｈ ｃ Ｆａ ｕｌａ ｉ ｅ Ｃａ ｌ ｆ Ｎｉ ｏ ｉ ｎ
ｔ ｂ ｃ ｍ ｎ ｔ ｌｕｒ ｎｄ ｔｏ ａ ａ ｕ ａ ｄ ＩｓＣｕ ｔ ｅ Ｃｏ ｉｉｎ
（－ ６糖基氨基嘌呤 ） ＋ ％蔗糖 ＋ ． ％琼脂的固体培养基成功诱导 了叶片的愈伤组织． ３ ０８ 通过 改变蔗糖浓 度和激 素配 比， 对兼性愈伤组织 的培养基进行 了筛选． 结果表 明 ： ５０ｌｓ 在 ０ 光照下 ， ｘ 蔗糖浓度 由 ３ ％降至 １５ ． ％时 ， 愈伤组织 有 变绿趋势 ； 蔗糖浓度 ＜１５ ．％时 ， 愈伤组织容易出现褐化．２ｍｇＬＮ Ａ（ 萘 乙酸 ） ＋ ．５ｍ ／ Ｔ的激素组合 可 ／ Ａ 一 ０ ２ ｇ ＬＫ 有效诱 导愈伤组 织的光合 兼养 ， 而单一植物激素如 Ｎ Ａ和 ６Ｂ ６苄氨基腺嘌呤 ） 不是 理想 的诱 导配方． Ａ －Ａ（ － ， 关 键词 愈伤诱 导 ； 组织培养 ； 光兼 养型 ； 烟草 Ｑ ４ ． 文献标识码 ９３ １ Ａ 文章编号 １７ ４３ １ ２ １ ）２０ ４ －３ ６２ ２ （０ ２ ０ －ｉａ ｏ ｆ２ ｍ ／ Ａ （ －ａ ｈ ｌ ｔ ） ｗｔ ０ ２ ｍ ／ Ｔ ｃｎ ｅｅｔ ｅ ｎ ｕｅ ｔ ｒｄ ｃｏ ｆ ｈ ｏ ｂｎｔ ｎ ｏ ｇ Ｌ Ｎ Ａ １ｎｐ ｔ ｃ ｉ ｉ ｈ ｅｃ ｉ ． ５ ｇ Ｌ Ｋ ａ ｆ ｃｉ ｌ ｉ ｃ ｈ ｐｏｕ ｔ ｎ ｏ ｈ ｆ ｖｙ ｄ ｅ ｉ ｐ ｏｏｕｏ ｏｈｃｆｃｌｔ ｅｃ ｌｓ ｗ ｅｅｓ ｈ ｎ ｕ ｌ ｔ ｏ ｏｅ ｕ ｈａ Ｎ Ａ ｏ －Ａ（ －ｅｚｌ ｉｏｕｉ ）ｃｎ ｈｔ ｔｒｐ ｉ ａｕｔ ｉ ａ ｕ ， ｈｒａ ｔｅｕ ｉ ｅｐ ｎ ｒ ｎ ，ｓｃ ｓ Ａ ｒ Ｂ ６ｂｎｙ ｍ ｎｐ ｒ ｅ ａ ａ ｔ ａｖ ｌ ｑ ａ ｈｍ ６ ａ ｎ
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
本生烟草愈伤组织的诱导和再生体系的建立
。有关本生烟 草转基 因的研 究也
基金项 目： 山东省 自然科学基金 （ 编号 ： Ｚ Ｒ ２ ０ １ ２ Ｃ Ｌ １ ４ ） ； 滨 州学院博士
基金 （ 编号 ： ２ ０ １ ０ Ｙ ０ ８ ） 。
作者简介 ： 陆玉建（ １ ９ ７ ９ 一） ， 男， 河南南阳人 ， 博士， 讲师 ， 研究方向为植
林业科技 ， ２ ０ ０ ５， ３ ２ （ １ ）： １ ３ ０—１ ３ ４ ．
［ ７ ］ 于福科 ， 张广军． 玫 瑰组织培养 污染控 制技术措施 ［ Ｊ ］ ．陕西农
业科学 ， ２ ０ ０ ２ （ １ １ ） ： ４ ７—４ ８ ．
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本生烟草愈伤组织的诱导和再生体系的建立
本生烟草愈伤组织的诱导和再生体系的建立作者：陆玉建刘俊华王书平高春明刘晓君任宇灵来源：《江苏农业科学》2014年第01期摘要：以本生烟草为材料，研究了不同激素组合对本生烟草愈伤组织诱导和植株再生的影响。
结果表明：当本生烟草叶片在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT培养基中培养时，其出愈率最高，愈伤组织生长状况最好；在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中不定芽生长最快，但存在一定程度的玻璃化现象；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培养基中不定芽长势较慢，但玻璃化程度较轻；对于生根诱导，MS、1/2MS培养基都可诱导不定根的产生，但NAA对根的生长更有效。
关键词：本生烟草；愈伤组织；不定芽；诱导；再生体系中图分类号： S572.043；Q943.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0052-03收稿日期：2013-05-17基金项目：山东省自然科学基金（编号：ZR2012CL14）；滨州学院博士基金（编号：2010Y08）。
作者简介：陆玉建（1979—），男，河南南阳人，博士，讲师，研究方向为植物生物技术。
Tel：（0543）3190096；E-mail：luyujian79@。
烟草是重要的经济作物，常被作为基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物[1-5]。
目前烟草遗传转化研究多用普通烟草（Nicotiana tabacum）作为受体，而对本生烟草（Nicotiana benthamiana）的研究相对较少。
本生烟草和普通烟草有密切的亲缘关系[6-7]，由于其植株矮小，生长速度快，生命周期短，对植物病毒非常敏感，所以是基因功能分析和植物病害研究的重要工具[4-8]。
有关本生烟草转基因的研究也见诸报道，通过在本生烟草中瞬时表达促红细胞生成素基因，能够生产重组蛋白-促红细胞生成素[9]。
利用本生烟草建立的质体转化系统，可以用来研究质体和细胞核基因间的相互作用，以及检测质体中相关基因的表达情况[7]。
烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生
烟草叶⽚愈伤组织的诱导与植株再⽣烟草叶⽚愈伤组织的诱导与植株再⽣2001级⽣物科学1班 200113515 黄麟飞摘要：在MS培养基上,接种烟草⽆菌苗的叶⽚,分别放在光照和⿊暗条件下诱导愈伤组织,接种于MS分化培养基上,在光照下分化再⽣植株。
结果表明:光照和植物⽣长调节剂对植物愈伤组织的诱导和植株再⽣产⽣影响。
关键词: 烟草愈伤组织植株再⽣Callus Inducement and Plant Regegeration Of TobaccoHuang LinfeiAbstract: culture the leaves of tobacco into MS inducing medium separately under light and darkness. Then culture the induced callus into MSregeneration medium under under light. The result sayed that callus inducement and plant regeneration of tobacco was effected by light and plant grow regulators.Key Word: tobacco callus plant regeneration⼆⼗⼀世纪是⽣命科学的时代，这⼀上世纪末科学家的语预⾔现在已经真切地在众多科技领域强⼤背景下款款⽽来了。
1998年8⽉12⽇美国总统克林顿发表了美国⽣物物质研究战略,决定2000年拨款2.1亿美元作为研究经费。
⽇本于2000年制定了“21世纪⽣物技术发展规划”，并提出了“⽣物产业利国”的⼝号[1]。
⽣物技术在医疗、保健、农业、环保、轻化⼯、⾷品等重要领域对改善⼈类健康与⽣存环境，提⾼农牧业与⼯业产量与质量都开始发挥越来越重要的作⽤。
⽣物技术涵盖的技术领域范围很⼴，包括遗传⼯程、细胞融合、细胞组织培养、胚胎及细胞核移植等技术。
花生愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
花生愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立黄文静;许春燕;何虎翼;邓伦武;李创珍;韦善清;何龙飞【摘要】With Zhonghua2 as material, the optimum culture conditions of callus induction and cell suspension culture were studied, the growth characteristics of suspension cell were detected, and a cell suspension culture system was established. The results showed that leaf was the best explant for callus induction and cell suspension culture, the optimal medium for callus induction was MS-+- 6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L,the optimal formula for suspension culture was MS+6-BA 2.0 rag/L+ 2,4-D 2. 0 mg/L + KT 1. 5 mg/L. The growth of suspension cells exhibited an S-shaped curve, growth mass reached the maximum after 12d culture, the optimal subculture cycle was around 12d. In the process of suspension culture, the suspension cell number exhibited the change trend: firstly increased, then decreased. The change trends of pH value and conductivity showed the same: firstly decreased, then increased, and then became stable.%以中花2号无菌苗为材料，对愈伤组织诱导和细胞悬浮培养的最佳条件进行探讨，并对悬浮细胞的生长特性进行检测，建立了花生悬浮细胞培养体系。
烟草叶片愈伤组织诱导与分化试验设计方案
烟草叶片愈伤组织诱导与分化试验设计方案生物112班第5组一、实验目的：诱导烟草叶片长出愈伤组织二、实验用具：超净工作台、镊子、手术剪、酒精灯、培养皿、广口瓶、高压灭菌锅等。
三、实验材料与试剂1．实验材料烟草叶片2．试剂 MS培养基、75%酒精、0.1%升汞、无菌水、6BA( 0.1mg/mL) , NAA(0.1mg/ml)等四、实验方法与步骤1．培养基的制备与灭菌按配制培养基的方法配制MS基本培养基250mL。
根据实验目的，采用培养基配方为MS+6BA(1.8mg/L) +NAA(1.0mg/L)。
所有培养基均附加30g/L蔗糖，4g/L琼脂粉。
在高压灭菌前将pH用1mol/LNaOH 调至5.8，然后分装到三角瓶，每瓶分装培养基大约40-50mL。
2．试剂、无菌水及培养皿的准备配制75%的酒精、0.1%升汞；将蒸馏水装入三角瓶或广口瓶，每瓶装50-60 mL，按照培养基灭菌的方法灭菌30min，即可获得无菌水；将剪裁好的滤纸放入洗净的培养皿中，每培养皿放3层，加少量蒸馏水润湿后，用牛皮纸或两层报纸将培养皿包严，高压灭菌30 min后备用。
3．接种室准备首先，用纱布蘸取75%酒精擦拭工作台台面，将接种用具、无菌蒸馏水、培养基等置于工作台上，打开工作台开关和紫外线灯，确认工作台正常送风后，开机30 min。
然后，用喷雾器向接种室空中喷洒75%酒精或打开接种室内的紫外线灯，进行空气灭菌。
4. 培养材料的表面灭菌从盆栽烟草植株上选取鲜绿、肥厚且充分展开的叶子，先用自来水冲洗30 min，用蒸馏水漂洗3次，然后在无菌条件下将其剪成适宜大小，放入广口瓶中。
先倒入75%酒精，摇动两三下（10s），立即将酒精倒出，然后加入0.1%升汞溶液，浸泡7min。
注意加入的升汞溶液应浸过叶片，浸泡过程中要不断摇动。
最后，将升汞倾出，加入无菌水摇动20-30 s倒出，重复用无菌水冲洗5次，备用。
5. 接种将经过表面灭菌的叶片按照无菌操作的要求取出，放入打开的无菌培养皿内。
烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生
Uc= (p 光-p 暗)/ p 平均=-0.6686 | Uc |=0.6686＜uα/2=2.58，故接纳 H0，拒绝 H1，即光照培养和黑暗条件下
培养的愈伤组织的诱导率无明显差异
3.3.2 平均每个愈伤组织分化芽数的差异显著性分析 假设：H0 是没有显著差异的
不同光照条件对愈伤组织诱导情况的方差分析表
注意在夹取外植体时动作要快，也要注意在对镊子高温消毒后要适 当冷却，否则会造成外植体失水或者烫伤而影响生长。并且要严格进行 无菌操作。
2.4 烟草植株的再生
将上述愈伤组织按类型顺次转到分化培养基上，接种 18 瓶，20~22 条 件下连续光照培养 3~4 周，直到长出芽。
3 结果与分析
3.1 愈伤组织诱导
态发生，使一个细胞、一个组织或一个器官的细胞通过脱分化形成愈伤组 织，并再分化成植株[2]。为了获得用于细胞大量培养的培养物，要从植物 不同的部位诱导生长旺盛的愈伤组织[3]。所谓愈伤组织原是指植物在受伤 后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中则指在人工培养基上 由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞[4]。目前组织培养中能重复地 形成愈伤组织和再生植株的一般限于从活跃分生组织部分而来的外植体， 如不成熟的幼胚、幼叶和幼花序，叶肉组织是一般常用的起始材料[5]。得
到愈伤组织以后，在愈伤组织继代培养时需要通过改进培养基和调整培 养温度与光照对培养条件进行优化，以获取最大的生物量和有用成分的 产率。
烟草是植物组织培养的四大典型实验植物之一，也是一种重要的经 济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。目前，通过烟草的花药培养， 原生质体培养，以及烟草叶组织培养已经成功获得烟草的体外再生植株。 烟草组织培养技术的成熟，为烟草的快速繁殖和新品种的筛选打下了坚 实的基础。
烟草叶片再生芽器官组织培养研究
烟草叶片再生芽器官组织培养研究烟草作为一种重要的经济作物，在全球范围内广泛种植。
叶片是烟草植株的重要组成部分，对其进行有效利用对于提高烟草产量和品质具有重要意义。
近年来，组织培养技术在植物繁殖和生产中发挥了重要作用，为烟草叶片的再生和利用提供了新的途径。
组织培养技术是一种通过无性繁殖产生完整植株的方法，具有繁殖速度快、不受季节限制、能保持原品种的优良性状等优点。
在烟草领域，叶片组织培养技术的研究已有一定的进展，但仍存在一些问题，如繁殖率低、产量不稳定等。
因此，本研究旨在通过改进组织培养技术，提高烟草叶片再生芽器官的繁殖率和产量，为烟草产业提供新的技术手段。
本研究采用了以下方法：选取健康的烟草叶片进行表面消毒，然后进行切割，得到带叶脉的叶片片段。
接着，将叶片片段接种在添加不同激素的培养基上，并进行培养条件控制，包括温度、湿度、光照等。
在培养过程中，观察并记录叶片片段的生长情况，包括愈伤组织形成、芽器官分化等情况。
对不同处理条件下的繁殖率和产量进行统计和分析。
结果表明，通过改进的组织培养技术，可以显著提高烟草叶片再生芽器官的繁殖率和产量。
在最佳培养条件下，繁殖率可达5倍，产量比常规组织培养技术提高20%。
本研究还发现，不同激素配比和处理条件对叶片再生芽器官的生长和分化具有显著影响。
本研究成功通过改进的组织培养技术提高了烟草叶片再生芽器官的繁殖率和产量，为烟草产业提供了一种新的技术手段。
然而，仍存在一些不足之处，例如培养周期较长、需要进一步优化培养基配方等。
因此，未来的研究方向可以包括缩短培养周期、优化培养基配方、探讨基因表达等方面的内容。
本研究也为其他作物组织培养技术的发展提供了有益的参考。
红花烟草是一种重要的经济作物，在烟草行业和植物生物技术领域具有广泛的应用价值。
通过对红花烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生研究，不仅可以提高烟草的产量和品质，还可以为植物生物技术的进一步发展提供有力的支持。
本文将介绍红花烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的意义、基本步骤、处理措施、最终效果及未来研究方向。
实验作业
实验一植物培养基的制备与灭菌
作业：
1、根据以下所给母液浓度、蔗糖和琼脂量，配制MS-1, MS-2, MS-3培养基。
按MS配方计算各种母液吸取量或药品的直接称量量。
4、观察并记录烟草微繁殖中芽的生长动态。
实验四烟草细胞悬浮培养
作业：
1、植物悬浮细胞是否可以在静止状态下进行培养而不需要振动？
2、试比较在液体培养中进行的细胞悬浮培养和在固体培养上进行的愈伤组织培养的异同。
实验五、烟草叶肉细胞原生质体游离
作业：
简述原生质体分离的方法。
实验六：烟草叶肉细胞原生质体融合
作业：
简述原生质体融合的方法。
实验七根癌农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化
作业：
1、高效遗传转化体系建立的基础是什么。
2、根癌农杆菌介导的遗传转化的影响因素有哪些。
实验八植物细胞活力的测定
作业：
1、用于植物细胞（或原生质体）活力测定的方法有哪些？
2、简述TTC法、FDA法、MTT法，以及染色法测定细胞活力的原理。
烟草悬浮细胞系的构建
种量（ｇ／皿）；出愈率 ＝（诱导出愈伤组织外植体数 ／接种的外 植体总数）×１００％。
综合比较 ９种培养基上愈伤组织的生长速度、出愈率、鲜 质量、形状、分散性、颜色等指标，筛选出诱导愈伤组织生长的 最佳配方，并将其配方作为愈伤组织继代和悬浮培养的配方。 １．２．２ 悬浮细胞系的建立 １．２．２．１ 不同接种量对悬浮细胞生长的影响 选取白色疏 松的愈伤组 织 １、２、３、４ｇ分 别接 种 于 １５０ｍＬ液 体 培 养 基 （“１．２．１”节中的配方）中，于 ２６℃、１４０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡暗培 养 ８ｄ后测定细胞鲜质量，３次重复。 １．２．２．２ 蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响 将“１．２．２．１” 节中最佳接种量培养 １０ｄ后的 ２０ｍＬ悬浮细胞转接到含有 １０、２０、３０、４０、５０ｇ／Ｌ蔗糖的 １３０ｍＬ新鲜液体培养基（“１．２． １”节中的配方）中，３次重复，于 ２６℃、１４０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡暗 培养 ８ｄ后测定细胞鲜质量。 １．２．２．３ 转速对悬浮细胞生长的影响 选用“１．２．２．１”节 和“１．２．２．２”节 筛 选 出 的 最 佳 接 种 量 和 蔗 糖 浓 度，制 成 液 体 培养基，分别于 １００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ｒ／ｍｉｎ的恒温摇床 上于 ２６℃振荡暗培养 ８ｄ后测定细胞鲜质量，３次重复。 １．２．３ 悬浮细胞生长曲线、活性变化及 ｐＨ值变化 根据 “１．２．２．１”节、“１．２．２．２”节和“１．２．２．３”节筛选出的最佳结 果，将悬浮细胞于 ２６℃振荡培养 １２ｄ，每隔 ２ｄ取样测定细 胞鲜质量、ｐＨ值和细胞活性，确定其生长周期。 １．２．４ 数值测定 １．２．４．１ 细胞鲜质量 根据李建安等介绍的方法［４］，具体操 作：取充分混匀悬浮细胞 ８ｍＬ，注入预先称质量的 １０ｍＬ离 心管中，在 ３５００ｒ／ｍｉｎ下离心 １０ｍｉｎ，吸去上清液，室温下敞 口自然风干 ２４ｈ后称质量，减去空管质量即为 ８ｍＬ悬浮细 胞的鲜质量。 １．２．４．２ 细 胞 活 性 测 定 按 照 孔 琼 等 介 绍 的 方 法 ［５］进 行。 即将 ０．２ｇ细胞加入 ３ｍＬ０．６％ ＴＴＣ溶液（用 ５０ｍｍｏｌ／ＬｐＨ 值 ７．５磷酸缓冲液配制，内含 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０），２６℃暗培 养 ２４ｈ，３５００ｒ／ｍｉｎ离心 １０ｍｉｎ，细胞转入大试管中后加入 ９５％乙醇 ５ｍＬ，８０℃水浴 ２０ｍｉｎ，冷却后 ３５００ｒ／ｍｉｎ离心
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证陈辉;姚志恒【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2009(037)014【摘要】[目的]研究烟草愈伤组织的发育情况及其丛生芽或分化点的形态建成.[方法]在无菌条件下,把烟草叶片切块培养在含有2mg/L NAA和1 mg/L6-BA的MS 培养基上诱导愈伤组织的形成;而后,转移愈伤组织到含有NAA 0.1 mg/L+BA 2.0 mg/L的分化培养基上使其产生丛生芽或分化点.[结果]诱导培养20 d后,愈伤组织基本形成且没有发生污染,烟草叶片愈伤组织的诱导培养是成功的.愈伤组织的整体分化率比较高,愈伤组织上形成的丛生芽或分化点比较多,且分布比较均匀;编号为4的分化培养基上愈伤组织的分化不理想,且其丛生芽或分化点分布极不均匀.在烟草叶片愈伤组织的分化培养中NAA和6-BA的添加量分别为0.1和2.0 mg/L.[结论]该研究为植株繁育提供了良好的技术支持.【总页数】2页(P6333-6334)【作者】陈辉;姚志恒【作者单位】荆州职业技术学院,湖北荆州,434020;荆州职业技术学院,湖北荆州,434020【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.培养基和继代时间对番茄叶片愈伤组织诱导和芽分化的影响 [J], 毕建水;李翠翠;徐丽丽2.灵发素(LFS)诱导烟草叶片愈伤组织的研究 [J], 李廷洋;周凤珏;许鸿源;周文亮;龚银花;赖洪敏;陈念平;解云英;许鸿章3.红花烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生 [J], 董行健;余宗波4.迷迭香叶片愈伤组织诱导及再分化培养 [J], 董玉梅;李正楠;钱成;刘宝刚;段如兰;刘雅婷5.汾阳核桃叶片愈伤组织的诱导、增殖及分化培养 [J], 张燕;范宏伟;张国强;张鹏飞;吴国良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
烟草光能兼养型愈伤组织的诱导和培养条件
烟草光能兼养型愈伤组织的诱导和培养条件余光辉;梅刘娟;余文卉;游文【摘要】以烟草SR1品种的4周龄叶片为外植体,使用MS＋2 mg/L 2,4 D（2,4-二氯苯氧乙酸）＋0.25mg/L KT（6-糖基氨基嘌呤）＋3%蔗糖＋0.8%琼脂的固体培养基成功诱导了叶片的愈伤组织.通过改变蔗糖浓度和激素配比,对兼性愈伤组织的培养基进行了筛选.结果表明：在500 lxs光照下,蔗糖浓度由3%降至1.5%时,愈伤组织有变绿趋势;蔗糖浓度〈1.5%时,愈伤组织容易出现褐化.2 mg/L NAA（α-萘乙酸）＋0.25 mg/L KT的激素组合可有效诱导愈伤组织的光合兼养,而单一植物激素如NAA和6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）,不是理想的诱导配方.%In this study, 4 weeks of tobacco cultuivar-SR1 leaves were used as the explants and solid culuter medium containing MS ＋ 2 mg/L 2,4-D （ 2,4-dichlorophenoxy ）＋ 0.25 mg/L KT （kinetin）＋ 3 % sucrose ＋ 0.8 % agar was employed to successfully induce the callus formation. Then culture mediums aiming for photoautotrophic facultative callus culture were screened by altering the sucrose concentrations and hormone combinations. Under the irradiation of 500 lxs light intensity, when the concentration of sucrose was reduced from 3% to 1. 5%, the callus tissue was found to increasingly turn green. However, when the concentration of sucrose was reduced to below 1.5% , it easily turned brown. The combination of 2 mg/L NAA （1-naphthlcetic）with 0. 25 mg/L KT can effectively induce the production of photoautotrophic facultative callus, whereas the unique plant hormone, such as NAA or 6-BA （6-benzylaminopurine） can not be used as the ideal medium for such induction.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(031)002【总页数】4页(P42-44,70)【关键词】愈伤诱导;组织培养;光兼养型;烟草【作者】余光辉;梅刘娟;余文卉;游文【作者单位】中南民族大学生命科学学院,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武汉430074;中南民族大学生命科学学院,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】Q943.1植物光自养微繁技术是一种生产优质种苗的植物微繁殖技术［1-3］(植物组织培养中以CO2代替糖作为植物体的碳源，控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型).由于该技术培养条件易控制［4］，污染率和成本低，适于大规模培养［1，2］，同时一些培养的光自养型细胞的光合活力和代谢性能可达到或接近连体叶片水平［5，6］，近年来已成为组织培养技术的新趋势和研究方向，可用来生产某些珍贵药材的药用成分［7，8］. 烟草是转基因技术中常见的材料［9］.近年侧重于以烟草叶片为外植体，研究重金属对烟草叶片组织培养的影响［10］，而将光自养型细胞无糖培养技术成功运用于烟草的报道较少［4，11］.由于自养型愈伤组织中天然活性产物的产量很大程度上受培养条件、时间、激素水平及外源添加物等影响，可通过改变培养条件以优化天然活性成分而达到生产的目的［8］，故笔者在前期建立的银杏和佛甲草异养型愈伤组织的培养体系基础上［7，12］，以4周龄生长旺盛的烟草叶片为外植体，探讨光能兼养型愈伤组织培养的条件，为药物植物光能自养型愈伤组织的培养提供一定的实践和理论依据.1 材料与方法1.1 仪器和试剂超净工作台(SWC-J-A智能型，上海新苗医疗器械制造有限公司)，恒温箱培养箱(SPX-250BS-II型，上海新苗医疗器械制造有限公司).MS(Murashige and Skoog)培养液(上海科兴贸易有限公司)，植物生长激素:2，4-D(2，4-dichlorophenoxy，2，4-二氯苯氧乙酸) 和 NAA(1-naphthlcetic acid，α-萘乙酸)(上海科兴生化试剂有限公司)，细胞分裂激素:KT(kinetin，6-糖基氨基嘌呤，激动素)和 6-BA(6-benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤)(上海拜力生物科技有限公司).1.2 烟草愈伤组织的诱导取4周龄生长旺盛的烟草叶片，先后用清水和蒸馏水清洗2～3次后用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗3～4次.用5%次氯酸钠(NaClO)浸泡消毒15min后，无菌水反复冲洗5～7次.灭菌滤纸吸干叶片水分，将叶片切成小块，接种于固体愈伤组织诱导培养基中，置26℃培养箱中黑暗倒置培养.培养基配方为 MS+2 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT+3%蔗糖+0.8% 琼脂.1.3 烟草异养型愈伤组织向光兼养型转变的诱导培养将异养型愈伤组织分别转接于下列4种固体培养基中，进行光自养的诱导.对培养基中的激素配比参考文献［2］，进行简化的正交实验(见表1).培养基中的蔗糖浓度于3% ～1.5%调整，在22℃，光照500 lxs下培养.表1 激素的因素水平表Tab.1 Factor-level of difierent hormones注:实验中 M1、M2、M3、M4 培养基分别为 A1 B1、A1 B2、A2 B1、A2 B2水平组合NAA(A)0.250 mg/L 0.125 mg/L 2.000 mg/L 1.000 mg/L KT(B)1.4 叶绿素含量测定叶绿素含量的测定和计算参考文献［13］.准确称取愈伤组织0.8g/份，加少许CaCO3、石英砂和2 mL 80%丙酮，研磨成匀浆，过滤后用滤液测叶绿素含量.以80%丙酮作参比，分别于663，646nm下测定滤液吸光值，按下列公式计算总叶绿素浓度(mg/L):Ct=17.32A646+7.18A663，叶绿素的含量(mg/g)=色素的浓度(mg/L)×提取液体积(L)×稀释倍数/样品质量(g).1.5 统计方法和计算公式2 结果与讨论2.1 烟草愈伤组织的诱导烟草异养型和兼养型愈伤组织的比较见图1.将烟草叶片接种于诱导培养基上2周后，可观察到质地松软生长情况良好的乳白色透明愈伤组织(见图1a).采用相同的培养基和培养条件，约3～4周继代一次，继代1～2次后，将愈伤组织置于光照(500 lxs)下培养.2周后，愈伤组织逐渐转变为浅绿色(见图1b)，作为进一步光能兼养型愈伤组织培养.实验中，光照条件下，愈伤组织逐渐变绿，由异养型转变为兼养型.但兼养型愈伤组织生长较异养型生长缓慢，且有逐步褐化和死亡现象.由于叶绿体尚未完全形成时，光照对愈伤组织造成光伤害，故实验中须随时注意观察愈伤组织的生长状态，及时继代.2.2 不同激素配比对光兼养型愈伤组织诱导的影响图1 烟草异养型和兼养型愈伤组织的比较Fig.1 Comparison of tobacco heterotrophic calluswith tobacco facultative callusa)异养型愈伤组织.培养基为MS+2 mg/L2，4-D+0.25 mg/L KT+3%蔗糖;b)兼养型愈伤组织.培养基同上激素水平是植物组织培养成功与否关键因素，不同激素配方的诱导率不同.通过对120个愈伤组织块的统计分析，烟草愈伤组织在较大范围的激素浓度配比下均能诱导形成兼养型愈伤组织，但诱导率存在较大差异.M1和M4诱导率最高，分别达71%和67%;M2和M3分别为53%和40%.经χ2检验，M1与 M4、M2与M3差异不显著(P ＞0.05)，M1与M2差异显著(P＜0.05)，即诱导率M1与M4显著高于M2与M3.说明生长素与分裂素(NAA+KT)适宜的浓度配比，有利于兼养型愈伤组织的诱导;而单一的激素如生长素(NAA)或分裂素(6-BA、KT)作用时诱导效果不理想.2.3 蔗糖浓度对光兼养型愈伤组织诱导的影响不同蔗糖浓度对光兼养型愈伤组织诱导的影响见图2.在低强度(500 lxs)光照下，蔗糖浓度由3%降至2%后，愈伤组织有变绿的趋势(见图2a～h).生长于M1和M4的愈伤组织较生长于M2和M3的更绿(见图2a、c、d、h)，其中生长在 M1培养基上愈伤组织颜色最绿，组织最蓬松(见图2a、c).此外，M1和 M4中叶绿素平均含量为 0.202，0.094 mg/g，M2和 M3中为0.065，0.068 mg/g.M1和M4叶绿素的含量较M2和M3高，与肉眼所见的绿色深浅度相符.说明M1和M4培养基更有利于光能兼养型愈伤组织的诱导和形成.继续在光照(500 lxs)下培养，将蔗糖浓度降低至1.5%，M1培养基上的愈伤组织由绿色变为深绿色，新长出的细胞呈现白色，随后逐渐变绿(见图2a、e、i).说明M1培养基的激素配方更有利用于继代培养;当蔗糖浓度＜1.5%时，褐化现象较为严重.因此，完全意义的光能兼养愈伤组织的培养条件尚需进一步探索.3 结语图2 不同蔗糖浓度时烟草兼养型愈伤组织的培养状况Fig.2 Condition of cultured facultative callus of Nicotiana tabacum under different sucroseconcentration～d，e～h，i～l) 分别为含3%，2%，1.5%蔗糖的 M1～M4培养基本实验通过逐渐降低培养基中蔗糖浓度的方法诱导烟草愈伤组织转变为光兼养型愈伤组织，并设计不同的激素配比，建立了诱导培养烟草光兼养型愈伤组织的方法.结果表明:用高浓度的生长素和分裂素的配合有利于兼养型愈伤组织的诱导，MS+2mg/L NAA+0.25mg/L KT 和 MS+1mg/L NAA+0.125mg/L KT两种培养基对兼养型愈伤组织的诱导率较高，分别达71%和67%;而单独使用6-BA分裂素或NAA生长素时兼养型愈伤组织的诱导率较低，仅为53%和40%.在提供光照，逐步降低糖浓度的过程中，不同激素配方中的愈伤组织逐步发育形成了叶绿体，以MS+2mg/L NAA+0.25mg/L KT的激素配方更有利于绿色愈伤组织的继代培养.本实验为研究兼养型愈伤组织中有用的次生代谢成分的产生积累提供了实验基础. 参考文献［1］侯典云，王聪睿，胥华伟，等.植物无糖组培快繁技术的应用［J］.安徽农学通报，2010，16(11):147-148.［2］牟宁宁，高亦珂.植物无糖组培技术研究进展［J］.林业科技开发，2007，21(1):10－12.［3］徐伟忠，丁潮洪，朱丽霞.一种新型光自养微繁体系的建立----植物非试管快繁技术［J］.江西农业学报，2006，18(3):55-59.［4］曾小美，王凌健，夏镇澳，等.胡萝卜光自养型愈伤组织的诱导培养及其光合特性［J］.实验生物学报，2006，36(1):18-22.［5］Carrier P，Chagvardief P，Tapie parison of the oxygen exchange between photosynthetic cell suspensions and detached leaves of Euphoria characias L［J］.Plant Physiol，1989，91(3):1075-1079.［6］Takeda S，Kaneko Y，Matsushinm H，et al.Cultured green cells oftobacco as a usefulmaterial for the study of chloroplast replication ［J］.Meth Cell Sci，1999，21(2-3):149-154.［7］齐小晴，彭斌，胡云虹，等.药用植物佛甲草愈伤组织的诱导和培养［J］.生物技术，2010，20(3):75-77.［8］赵春梅.植物组织培养方法生产药用次生代谢产物研究进展［J］.现代生物医学进展，2008，8(4):790-795.［9］肖军，张云霄，刘伯峰.烟草的组织培养技术研究［J］.泰山学院学报，2009，31(6):94-98.［10］周仕顺，掏志章.烟草的组织培养［J］.云南农业科技，2005，28(5):85-87. ［11］屈云慧，熊丽，张素芳.情人草组培苗无糖培养应用研究［J］.华中农业大学学报，2004，35:192-193.［12］胡云虹，彭斌.银杏愈伤组织和叶中超氧化物歧化酶和总黄酮类抗氧化活性剂活性的比较分析［J］.武汉植物学研究，2010，28(4):521-526.［13］崔勤，李新丽，翟淑芝.小麦叶片叶绿素含量测定的分光光度计法［J］.安徽农业科学，2006，34(10):2063.【相关文献】使用R×2表χ2检验不同激素配方中兼养型烟草愈伤组织诱导率(诱导率=变绿的愈伤组织块数/总的愈伤组织块数×100%)之间的差异，调整每次检验的显著水平α'=2α/(R(R－1))=0.0083，式中R=4(两两检验的样品率个数)，α=0.05.计算ν=3 时χ2值，对 M1、M2、M3、M4 两两比较.。
烟草叶片愈伤组织诱导及分化培养的验证
+ + 都较均匀
+
1块上面较43; 分化出了大量丛生芽 ,且均匀
注 :“ + ”表示极度分布不均 ,多数在一个以下 ;“ + + ”表示均匀分布 ,但都较小 ,多为分化点 ,且其数量在 10～20;“ + + + ”表示分布均匀 ,且都很 多 ,最少的愈伤组织上至少也有 20个丛生芽或者分化点。
愈伤组织形成数 ∥块
诱导率 ∥%
愈伤组织生长状态
Pollution number 0 0 0 0 0
Callus number 5 4 4 3 5
Induction rate 100 80 80 60 100
Growth state of callus 5块都比较大 ,且较均匀 有 2块较小 不均匀 , 2块中等 , 2块很小 2块较小 , 1块上面有黑点 中等均匀
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6334
安徽农业科学 2009年
ferentiation point, the number is 10 - 20; + + + indicates the distribution is even and much, the least callus number is 20 multip le shoots or differen2
分化数
D ifferentiation number 5 5 4 3 5
分化率 ∥% D ifferentiation
rate 100 100 80 60 100
烟草植物组织培养实验报告
烟草叶片的组织培养一、实验目的本实验通过配制3种不同的培养基来实现烟草种子苗叶片诱导、分化及植株再生从而深刻理解植物细胞的全能性、学习和掌握植物组织培养技术，二、实验原理植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。
由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。
本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。
在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
培养基配方设计是组培法育苗中的关键步骤。
根据理论与实际经验，对不同种类的花卉及不同的取材部位，需设计出相适应的配方，并从中筛选出最佳者。
继代芽增殖培养：很多花卉植物经过2-6周的培养即可分化出大量的不定芽。
根据情况可以将这些增殖了大量新芽的外植体重新分割进行几代培养，以扩大繁殖规模直至满足繁殖需要为止。
三、实验材料植物材料：烟草植株药品：激素（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1N NaOH、1N HCl蒸馏水、 70%酒精、 0.01%升汞仪器：1玻璃杯、1玻璃棒、1pH试纸(5.5-9.0)1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子四、实验方法与步骤4.1 MS培养基母液的配制注意：1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O 单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
灵发素(LFS)诱导烟草叶片愈伤组织的研究
灵发素(LFS)诱导烟草叶片愈伤组织的研究李廷洋;周凤珏;许鸿源;周文亮;龚银花;赖洪敏;陈念平;解云英;许鸿章【摘要】[目的]研究LFS诱导烟草叶片愈伤组织的生物活性和使用浓度;[方法]以MS为基本培养基,添加不同浓度LFS配制成诱导培养基,以烟草幼叶切片作外植体,进行愈伤组织诱导;[结果]1)LFS 0.05～2.00 mg/L皆表现出诱导烟草叶片愈伤组织的生物活性;2)最适浓度为1.50 mg/L,1o d出愈率48％,20 d达100％.愈伤组织的褐化与板结程度轻微,每瓶平均鲜重产量为8.3g,而ck组只有1.7 g;[结论]LFS作为单一诱导剂添加于MS可以快速、优质、高效地获得烟草叶片愈伤组织.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2017(036)004【总页数】3页(P126-128)【关键词】灵发素;烟草;愈伤组织【作者】李廷洋;周凤珏;许鸿源;周文亮;龚银花;赖洪敏;陈念平;解云英;许鸿章【作者单位】广西大学,南宁530005;广西大学,南宁530005;广西大学,南宁530005;广西壮族自治区烟草公司百色市公司,广西百色533899;广西大学,南宁530005;广西壮族自治区烟草公司百色市公司,广西百色533899;广西大学,南宁530005;中国医学科学院医用生物技术研究所,北京100050;中国医学科学院医用生物技术研究所,北京100050【正文语种】中文【中图分类】S572烟草(Nicotiana tabacum L.)的愈伤组织(Callus)是生产再生植株，获得遗传良性变异，进行品种改良的重要材料。
同时，烟草作为植物生物技术研究的模式植物，其愈伤组织也是细胞生物学、分子生物学和基因学等基础研究的重要试验材料。
有关获得烟草愈伤组织的技术研究报告颇多，但是归纳起来，其共同点有： 1) 基本培养基。
绝大多数是用MS(Murashige和Skoog,1962)，偶然有用H(Bourgin 和Nitsch,1967)。
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基金项目:河南省科技厅“烟草细胞和发状根培养中茄尼醇的合成研究”(524420033)项目和郑州大学青年骨干教师资助项目“烟草中萜烯类次生代谢物的合成研究”资助。
作者简介:岳彩鹏(1974-),女,博士,郑州大学讲师,主要从事烟草生理研究。
E 2mail:yuecai peng@zzu .edu .cn 收稿日期:2007-05-21责任编辑:董志坚 E 2mail:yckj2256@yahoo 电话:0371267672650烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立岳彩鹏,李 品,黄象男,朱大恒郑州大学生物工程系,郑州市科学大道100号 450001关键词:烟草;愈伤组织;悬浮培养;白肋烟;鄂烟1号摘要:以鄂烟1号无菌苗的叶为材料进行愈伤组织的诱导,筛选出生长培养基的最佳激素配比,初步建立了烟草细胞悬浮培养体系。
结果表明,愈伤组织诱导的最优基本培养基为MS 培养基,以MS +NAA 110mg /L +6-BA 0.5mg/L 为最佳配方;愈伤组织最佳生长培养基为MS +2,4-D 011mg/L +NAA 115mg/L +6-BA 013mg/L,愈伤组织培养第6天进入对数生长期,第14天干重增至最初干重的12.536倍,并以此配方建立了烟草细胞悬浮培养体系。
中图分类号:S572.01 文献标识码:B 文章编号:1002-0861(2007)10-0056-04Tobacco Ca llus I nducti on and Est ablish m en t of Cell Suspen si on Culture Syste m Y UE CA I 2PENG,L I P I N ,HUANG X I A NG 2NAN,and Z HU DA 2HENG B i oengineering Depart m ent,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China Keywords:T obacco;Callus;Sus pensi on culture;Burley t obacco;E ’yan 1Abstract:The callus inducti on was carried out with the leaves of asep tic seedling of t obacco E ’yan 1,and the op ti m al hor mone p r oporti on in culture medium was screened out,and the syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established p reli m inarily .The results showed thatMS was the op ti m al basic mediu m for callus inducti on,and the op ti m al f or mula was MS +NAA 1.0mg/L +62BA 0.5mg/L;while the op ti m al f or mula for culture mediu m of callus wasMS +2,42D 0.1mg/L +NAA 1.5mg/L +62BA 0.3mg/L.On the 6th day of callus culturing,the l ogarith m gr owth peri od started;and on the 14th day,the dry weight increased t o 12.536ti m es of its initial dry weight .The syste m of t obacco cell sus pensi on culture was established based on this f or mula . 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段,同时也是植物改良、种质保存和次生物质生产的理想途径[1]。
有关烟草组织和细胞培养已有不少报道[225],近年来在抗性研究、基因转化和次生物质生产等方面也取得一些进展[629]。
有研究表明[10],以植物悬浮培养细胞为材料生产次生代谢物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点。
烟草中含有大量次生代谢物,因此,建立稳定而具有高活力的烟草悬浮培养细胞体系对次生代谢物的生产有重要意义。
到目前在白肋烟的愈伤组织培养和细胞悬浮培养方面的研究报道较少。
本试验以白肋烟鄂烟1号的叶为材料进行了愈伤组织的诱导,确定获得脆散性愈伤组织的最佳激素配比,并以此为基础建立起烟草细胞悬浮培养体系,旨在为烟草中次生物质的生物开发利用提供依据。
1 材料与方法1.1 试验材料鄂烟1号烟草种子,由郑州烟草研究院提供。
1.2 试验方法1.2.1 无菌苗的获得将烟草种子用70%酒精浸泡1m in,10% NaCl O消毒10m in,经无菌水漂洗后接种于无激素的MS固体培养基,28℃下暗培养,之后将未污染的发芽种子转接到MS固体培养基上,于28℃下光照培养16h,得无菌种子幼苗。
1.2.2 初始愈伤组织诱导和基本生长培养基的筛选取无菌苗叶片外植体,切成5mm×5mm的小块,接种在加有激素的3种基本培养基上,各处理见表1。
28℃下暗培养,15d后得到初始愈伤组织。
1.2.3 愈伤组织的继代和最佳生长培养基激素配比的筛选在基本培养基筛选的基础上,筛选出最优基本培养基为MS培养基,其对激素配比做进一步的调整细化,见表2,选取长势较好的愈伤组织继代培养,筛选最佳生长培养基。
1.2.4 脆散性愈伤组织的获得按已确定的生长培养基配方配制固体生长培养基,选择长势较好、黄白色的愈伤组织进行继代,28℃下暗培养,第4代后获得脆散性愈伤组织。
1.2.5 愈伤组织的鲜重、干重生长倍增曲线的绘制按已确定的最优生长培养基配方配制固体培养基,灭菌分装于三角瓶中。
将切好的脆散性愈伤组织称重后接种于编号的三角瓶中,记录m1;于28℃下暗培养,每2d取样1次,每次取样3瓶,称取愈伤组织鲜重,记录m2;将愈伤组织烘干至恒重,称重记录m3。
每次取样的愈伤组织鲜重与干重倍增值的计算方法:愈伤组织鲜重倍增值F=m2/m1愈伤组织干重倍增值D=m3/(m1・115%)式中:115%为接种愈伤组织的生物干重百分率。
依据愈伤组织鲜重与干重倍增值的平均值绘制生长曲线。
1.2.6 烟草细胞悬浮培养体系的建立按已确定的生长培养基配方配制液体生长培养基,将疏松愈伤组织用玻璃棒碾碎,每瓶加入一定量的愈伤组织,pH值为5.7～518,28℃下摇床暗培养,摇床转速110r pm。
表1 诱导培养基的激素配比激素(mg/L)M S①B5②NT③MS1M S2MS3MS4B51B52B53B54NT1NT2NT3NT4NT5NT6NT72,4-D④3.01.0——1.0———2.01.02.0————KT⑤0.20.5——0.5———0.20.50.5————NAA⑥——1.00.5—0.51.00.5———0.51.02.00.5 6-BA⑦——0.51.0—0.50.51.0———0.50.50.51.0 注:①M urashige-Skoog培养基;②Ga mborg培养基;③Nagata-Takebe培养基;④2,4-二氯苯氧乙酸;⑤激动素;⑥萘乙酸;⑦6-苄基氨基嘌呤。
表2 生长培养基的激素配比编号2,4-D(mg/L)KT(mg/L)NAA(mg/L)6-BA(mg/L)MS5——0.50.3 MS6——0.50.5 MS4——0.51.0 MS7——0.750.5 MS8——0.750.75 MS9——1.00.3 MS3——1.00.5 M S10——1.00.75 M S11——1.50.3 M S12——2.00.3 M S130.10.02——M S140.10.05——M S150.10.1——编号2,4-D(mg/L)KT(mg/L)NAA(mg/L)6-BA(mg/L) MS160.10.2——MS170.10.3——MS180.50.1——MS190.50.2——MS200.50.3——MS210.30.02——MS221.00.2——MS232.00.2——MS240.1—0.50.5 MS250.1—0.50.3 MS260.1—1.50.3 MS270.3—1.50.3 MS280.1—2.00.32 结果与讨论2.1 烟草愈伤组织的诱导和基本培养基的筛选将烟草外植体接种到基本培养基上,28℃下暗培养15d,观察外植体生长分化的情况,获得一系列不同分化程度的烟草愈伤组织,见表3。
由表3可见,3种基本培养基中激素组合NAA+6-BA的烟草愈伤组织诱导率优于2,4-D+KT,NT基本培养基上烟草愈伤组织的诱导率很低。
MS培养基的各种处理诱导出愈伤组织最快,约6～8d;B5基本培养基约为10～12d;在NT 基本培养基上的诱导时间较长,约35～40d,而且外植体的死亡率也比MS和B5基本培养基高。
因此NT培养基不适合本实验材料愈伤组织的诱导。
在MS培养基和B5培养基上,加2,4-D激素虽然有抑制芽分化的作用,但是浓度高于1.0 mg/L时会使愈伤组织变黑,对细胞生长不利。
MS培养基上,MS3(NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,烟草胚性愈伤组织的诱导率较高,没有褐化,MS4(NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L)次之,MS1(2,4-D3.0mg/L+KT0.2 mg/L)褐化严重;B5基本培养基上,B53(NAA 1.0mg/L+6-BA0.5mg/L)的效果最好,B54 (NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L)次之。
可见, 3种培养基中MS基本培养基适合本实验材料外植体的诱导。
2.2 最佳生长培养基激素配比的筛选和脆散性愈伤组织的获得在基本培养基中选择烟草细胞脱分化程度高、生长快的培养基配方MS+NAA1.0mg/L+6 -BA0.5mg/L、MS+NAA0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L和MS+2,4-D1.0mg/L+KT0.5mg/ L,以此为基础对激素配比作进一步的调整(表2),选择长势较好,淡黄色的愈伤组织切成小块,接种到新鲜的培养基上。
28℃下暗培养15d,观察结果见表4。
表3 不同基本培养基烟草外植体愈伤组织的诱导项目MS B5NTMS1MS2M S3MS4B51B52B53B54NT1NT2NT3NT4NT5NT6NT7外植体数(个)2319141418991412161413141218愈伤组织数(个)231614141789120204120颜色发褐数(个)23801238010000000诱导率(%)10084.210010094.488.910085.7012.5030.87.116.70表4 M S培养基上愈伤组织的生长状况编号褐化程度①分化程度②愈伤组织体积大小MS5+++++ MS6+++++ MS4+++++++++ MS7++++ MS8++++++ MS9++++ MS3+++++ M S10+++++ M S11++++ M S12++ M S13++++ M S14+++++ M S15+++++编号褐化程度①分化程度②愈伤组织体积大小MS16++++++ MS17+++++++ MS18++++ MS19+++ MS20++++++ MS21++++ MS22++++MS23++++++ MS24+++++ MS25+++++ MS26+++++ MS27++++ MS28+++ 注:①“+”表示程度的高低。