(完整)胎盘间充质干细胞的分离和培养 2016.07.21
一种胎盘间充质干细胞的分离方法[发明专利]
![一种胎盘间充质干细胞的分离方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/69215b33a7c30c22590102020740be1e650ecc20.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811472346.6(22)申请日 2018.12.04(71)申请人 青岛奥克生物开发有限公司地址 266000 山东省青岛市高新技术产业开发区广博路3号(72)发明人 贾在美 黄玉香 刘超 姜磊 刘艳妍 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569代理人 刘奇(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称一种胎盘间充质干细胞的分离方法(57)摘要本发明提供了一种胎盘间充质干细胞的分离方法，属于生物技术领域。
本发明先取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，滤板中心位置设置圆孔；滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔；然后通过圆孔向离心管中加入细胞分离液至液面没过滤板；再将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min；最后倒掉滤板上层消化液，用吸管穿过圆孔，吸取得到含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。
本发明提供的方法不用中和胰酶，不须用100um细胞筛网过滤，操作简单、快速，能提高干细胞产量和活力。
权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 109536442 A 2019.03.29C N 109536442A1.一种胎盘间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取离心管，在垂直于离心管轴线的平面上放置一片滤板，使滤板下方的离心管容积占离心管总容积的20～40％，所述滤板的中心位置设置一个用于加液的圆孔，所述圆孔的直径为0.45～0.75cm；所述滤板还设置若干个相互平行的条形筛条，每两个相邻筛条之间形成长方形筛孔，所述筛孔的宽为0.15～0.25cm；(2)通过步骤(1)所述圆孔向离心管中加入细胞分离液，所述细胞分离液的添加量以没过滤板为标准；(3)将新鲜的胎盘组织消化液加入到离心管中，1000～2000rpm离心10～30min，实现组织消化液的分层；(4)倒掉滤板上层消化液，穿过圆孔吸取滤板下的含有胎盘间充质干细胞的细胞分离液。
胎盘间充质干细胞的分离和培养
胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定刘亭2016、7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织得选取 (3)2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5)2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5)2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6)3 原代培养与继代培养 (10)3-1培养基 (10)3-2培养密度 (11)3—3培养条件 (11)3—4换液 (11)3-5 传代培养 (12)3-6细胞形态与生长速度 (12)3-7 MSC得冻存与复苏: (12)4细胞表面抗原检测 (13)5生长曲线 (13)6细胞周期 (13)7分化潜能 (13)参考文献 (13)附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15)脐带血 (15)脐带 (15)羊膜 (17)绒毛膜 (17)蜕膜层 (18)胎盘 (18)整体灌注法 (20)附件2 背景知识 (20)附件3 PMSC实验所需试剂 (20)前言干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。
在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。
胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。
但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。
然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。
胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP
胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP一、样本接收1.正常足月顺产男婴，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下获取胎盘，放至无菌袋中，4℃运输至细胞中心。
2.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
3.查看客户信息是否与交接表一致。
4.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种1.准备耗材试剂：15cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、封口膜、100目滤网过筛、灭菌手术刀、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、DPBS、双抗、75%酒精（已过滤）、Ⅰ型胶原酶。
2.仪器设备准备及预热：生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、电动移液器、倒置相差显微镜、摇床（37℃150r/min）。
3.将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4.将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，实验中所需要的相关试剂及耗材等喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5.取无菌托盘，加入含1%青链霉素的DPBS，将胎盘组织放入其中，并取适量样本保存液留样送检支原体。
并洗涤组织两三次，洗去表面的血污，直至清洗的液体无血色。
6.清洗结束后，将胎盘放入无菌托盘中，然后使用无菌剪刀分离胎盘底部靠近母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎至1-3mm3的微小组织块，加DPBS定容离心，500g 5min。
7.离心结束后，去上清。
按照蜕膜组织与消化液体积比为2:5的比例加入消化酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化至少一个小时，再按消化酶与0.05%的胰酶体积比为1:1的比例加入0.05%的胰酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化15min。
8.用无血清干细胞培养基终止消化，吹打悬液20-30次，打散组织，混匀细胞，将消化的组织液通过100um细胞筛网过滤出组织和胎盘蜕膜间充质干细胞两部分，组织留在滤网上，下层则是细胞悬液，加DPBS定容混匀离心。
人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离与纯化
中国组织工程研究与临床康复 第 14 卷 第 10 期 2010–03–05 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 5, 2010 Vol.14, No.10
摘要
背景：胎盘的细胞成分较复杂，其中所包含的滋养细胞在母胎免疫耐受过程中起重要作用，胎盘间充质干细胞具有多向分 化潜能以及抑制淋巴细胞增殖的特性，常规分离方法通常难以获得大量且纯度较高的上述两种细胞。 目的：拟建立一次操作即可同时获得大量、较高纯度的滋养细胞和胎盘间充质干细胞的操作方案。 方法：人胎盘组织洗净剪碎，采用胰蛋白酶和 DNAse Ⅰ共同消化，分 3 个阶段，每个阶段在恒温 37 ℃下 180 r/min 消化 2 min。重悬消化产物，200 目筛网过滤后采用 Percoll 密度梯度分离液分离，分别收集滋养细胞层和胎盘间充质干细 胞层。滋养细胞层以差速贴壁法去除成纤维细胞，胎盘间充质干细胞直接接种于 75 cm2 培养瓶中培养。观察胎盘组织消化 情况，计数滋养细胞数量及其细胞角蛋白 7 的表达，观察胎盘间充质干细胞生长增殖、表型及成骨分化潜能。 结果与结论：经胰蛋白酶和 DNAse Ⅰ消化后，胎盘组织仅剩少许残渣。差速贴壁后，滋养细胞数达(5.48±1.98)×108 个， 细胞角蛋白 7 阳性率为(90±4.36)%。胎盘间充质干细胞接种 19~21 d 达 90%融合，细胞数为(1.96±0.24)×106 个，强表达 CD29，CD44 和 HLA-ABC，不表达 CD34，CD45，CD14 和 HLA-DR，诱导后茜素红染色呈鲜艳橙红色，可向成骨细胞 方向分化。提示采用胰蛋白酶和 DNAseⅠ共同消化胎盘组织，并结合 Percoll 不连续密度梯度分离液分离细胞，可同时一 次性获得大量的滋养细胞和较多的胎盘间充质干细胞，细胞纯度和活性均较好。 关键词：胎盘组织；滋养细胞；胰蛋白酶；DNAseⅠ；Percoll；纯度；胎盘间充质干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.10.026
胎盘间充质干细胞的分离和培养 XX6.07.21
小时候，场队里面有片我一眼望不到边的荷塘。
妈妈经常带着我到荷塘边采莲叶摘莲蓬剥莲子，我边走边跳的跟着，嘴里连说带唱地念：“毕竟西湖六月中，风光不与四时同。
接天莲叶无穷碧，映日荷花别样红。
”妈妈教的杨万里的诗。
碧绿的荷塘里高低错落地盛开着粉白的粉红的荷花，有的羞答答地躲在莲叶下，有的则大方地在艳阳下舒展妙曼的身姿，把小蜜蜂忙得不停地在花瓣中花蕊里飞来飞去。
清风一阵阵地送着荷花的芬香，莲叶与荷花在低头细语，沙沙，沙沙。
只可惜，我听不懂它们说的话。
妈妈，荷花真香真美啊！嗯。
妈妈摘一朵给你。
不，妈妈，摘下了它，它会死的。
让它长在塘里，一大片一大片的，它才高兴才会香才会更美丽。
好吧，女儿，让它们美美的长着。
来，我们把莲子莲叶都拿回家里蒸饭和做莲子羹。
好，妈妈，莲子羹最好吃了胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7.21目录前言 (4)1分离制备PMSC组织的选取 (5)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (7)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (7)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (8)3 原代培养和继代培养 (12)3-1培养基 (12)3-2培养密度 (13)3-3培养条件 (13)3-4换液 (13)3-5 传代培养 (14)3-6细胞形态与生长速度 (14)3-7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (15)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (17)脐带血 (17)脐带 (18)羊膜 (19)绒毛膜 (20)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
胎盘间充质干细胞的分离和培养
胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7.21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (7)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (7)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (8)3 原代培养和继代培养 (13)3-1培养基 (13)3-2培养密度 (14)3-3培养条件 (15)3-4换液 (15)3-5 传代培养 (16)3-6细胞形态与生长速度 (16)3-7 MSC的冻存与复苏： (16)4细胞表面抗原检测 (17)5生长曲线 (17)6细胞周期 (17)7分化潜能 (17)参考文献 (17)附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法 (19)脐带血 (19)脐带 (20)羊膜 (22)绒毛膜 (23)蜕膜层 (24)胎盘 (24)整体灌注法 (26)附件2 背景知识 (27)附件3 PMSC实验所需试剂 (27)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。
但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞（Mesenchymal stem cell, MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
人胎盘间充质干细胞的分离与鉴定
人胎盘间充质干细胞的分离与鉴定王立斌;刘婷;马晓娜;李玉奎;魏军【摘要】目的从生产后胎盘中提取胎盘间充质干细胞,并对其进行干细胞特性鉴定. 方法采用酶直接消化法从胎盘组织中提取间充质干细胞,并利用流式细胞术及染色体核型分析技术鉴定其干细胞特性. 结果成功获得胎盘间充质干细胞,培养48h后即可见贴壁细胞,形态为成纤维细胞样,漩涡状生长,传代过程中细胞形态和特性未见明显变化,经细胞表面分子及染色体核型分析,证明其具备干细胞特性. 结论用酶直接消化法所获得的胎盘问充质干细胞具备干细胞特性,可以作为临床干细胞治疗的种子细胞.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2010(032)008【总页数】3页(P864-866)【关键词】胎盘;间充质干细胞;流式细胞术【作者】王立斌;刘婷;马晓娜;李玉奎;魏军【作者单位】宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所,银川,750004;宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所,银川,750004;宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所,银川,750004;宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所,银川,750004;宁夏医科大学附属医院宁夏人类干细胞研究所,银川,750004【正文语种】中文【中图分类】R714.56间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞，近几年来有学者发现胎盘中含有丰富的间充质干细胞，提示可以将其提取作为干细胞移植治疗的备选细胞［1］。
胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞［2］。
本研究利用酶消化法直接从人胎盘组织中提取间充质干细胞，并对其干细胞特性进行了鉴定，为研究胎盘间充质干细胞分化能力，将其作为种子细胞开展临床应用研究提供依据。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要仪器及试剂倒置显微镜(Olympus，日本)，二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，超净工作台(苏州安泰)，移液器(Eppendorf，德国)，染色体核型分系统(Cytovision，AI，UK)，流式细胞仪(BD，美国)，胎牛血清(FBS，Gibco)，L－DMEM(Invitrogen)，青/链霉素，Antibiotic(Invitrogen)，IV型胶原酶(Collagenase IV，Gibco)，Dispase Ⅱ(Roche)，L－谷氨酰胺(Invitrogen)，鼠抗人单克隆抗体 IgG2a－FITC，IgG1－PE，CD29－PE，CD34－PE，CD44－FITC，CD105－FITC(均为 BD 公司生产)，植物细胞凝集素(Phaseolus vulgaris agglutinin，PHA)，胰蛋白酶(Trypsin，Invitrogen)，秋水仙素(上海试剂厂)，Gimesa(湖南湘雅基因技术有限公司)等。
人胎盘源间充质干细胞的分离、培养及生物学鉴定
人胎盘源间充质干细胞的分离、培养及生物学鉴定赖平;陈懿建;罗耀玲;张敏鸿;杨建琼;邱悦群【摘要】目的:探讨机械剪碎组织加酶液消化法分离、培养人胎盘间充质干细胞的可行性,并对间充质干细胞进行生物学鉴定.方法:取足月产人胎盘,采用机械剪碎组织加酶液消化法分离,密度梯度离心法提纯胎盘组织中的细胞,利用细胞生长特性对细胞进行进一步分离、纯化并传代培养,倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表面标记.结果:在倒置显微镜下,细胞为贴壁生长,形态呈长梭形,少数为多角形,胎盘组织来源间充质干细胞在体外可稳定长期传代培养,应用流式细胞仪检测结果显示CD73、CD90、CD105表达阳性,CD34 、CD45、HLADR表达阴性.结论:联合利用机械剪碎胎盘组织和酶消化法可高效获取胎盘间充质干细胞,获取的胎盘间充质干细胞在体外培养过程中生长稳定,增殖能力强,可长期传代或冻存.【期刊名称】《赣南医学院学报》【年(卷),期】2016(036)002【总页数】4页(P183-186)【关键词】人胎盘间充质干细胞;机械剪碎;酶消化;干细胞培养【作者】赖平;陈懿建;罗耀玲;张敏鸿;杨建琼;邱悦群【作者单位】赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院血液科,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院临床科研中心,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院临床科研中心,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院临床科研中心,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1间充质干细胞在一定的条件下可以被诱导分化为多种类型的组织细胞，一直被认为是极佳的进行科学研究和医用资源[1]。
干细胞可通过骨髓、脂肪组织、脐带血等途径获取。
以往的获取途径因受到道德及伦理的限制不能广泛开展。
虽来源广泛，不同来源的干细胞获取、分离、纯化困难也大大限制了其应用。
胎盘中有大量的滋养细胞及丰富的胚外中胚层的间充质和血管[2]，从中获取的干细胞可以很好的解决干细胞缺乏的现状。
人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究
人胎盘底蜕膜间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究卢国辉;张世忠;陈强;王雪峰;卢凤飞;刘剑;李明;李振勇【摘要】目的探讨人胎盘底蜕膜间充质干细胞(MSCs)体外生物学特性,并验证其多向分化潜能.方法通过酶消化和密度梯度离心法从人足月胎盘底蜕膜中获取MSCs,倒置显微镜下观察其形态变化和生长特点;CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期及表面抗原(CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14)的表达;在特定诱导条件下,使其向成骨、成脂、成软骨方向分化,鉴定其多向分化潜能.结果人足月胎盘底蜕膜中分离的MSCs呈克隆样生长,形态类似于骨髓MSCs,传代后细胞增殖迅速,细胞倍增时间为(2.21±0.21)d;大于70%的细胞处于静止期(G0/G1期),阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90,不表达CD34、CD45、CD14;经诱导后茜素红染色、油红O染色和Alcian blue染色均呈阳性表现.结论胎盘底蜕膜中含有丰富的MSCs,易于体外分离培养,且具有多向分化潜能,有希望成为另一新颖的干细胞来源.%Objective To investigate the biological features of human decidua basalis-derived mesenchymal stem cells (PDB-MSCs) in vitro and identify their capacity of multilineage differentiation. Methods PDB-MSCs were harvested from the decidua basalis of term placental by enzymatic digestion and density gradient centrifugation, and the growth characteristics and morphological changes of the MSCs were observed by inverted microscope. The proliferative ability of the cells was assessed by Cell Counting Kit-8. The cell cycle and expressions of the surface markers (CD29, CD44, CD73, CD90, CD34, CD45, and CD14) of the MSCs were identified by flow cytometry. Multilineage differentiationcapacity of the cells was tested by inducing their differentiation toward osteoblasts, adipocytes and chondroblasts in vitro. Results MSCs isolated from human decidua basalis of term placental exhibited a morphology similar to that of bone marrow-derived MSCs, and grew into colonies in in vitro culture, where the cells proliferated rapidly after passage with a cell doubling time of 2.21 ±0.21 days. More than 70% of the cells stayed in the resting stage (Gu/G1) and showed positivity for CD29, CD44, CD73 andCD90, but not for CD14, CD34 or CD45. After induction, the cells showed positive results of alizarin red staining, oil red O staining and Alcian blue staining. Conclusion Human decidua basalis contains a rich source of MSCs, which can be easily isolated and cultured without affecting their capacityof multilineage differentiation. The PDB-MSCs may have the potential as a novel source of stem cells.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2011(031)002【总页数】4页(P262-265)【关键词】间充质干细胞;底蜕膜;分离培养;多向分化【作者】卢国辉;张世忠;陈强;王雪峰;卢凤飞;刘剑;李明;李振勇【作者单位】南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院妇产科,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282;南方医科大学珠江医院神经外科研究所,广东,广州,510282【正文语种】中文【中图分类】R331.22;R329.24间充质干细胞（MSCs）作为一类具有未分化细胞特性，能高效率自我更新，并且具有多向分化潜能的干细胞[1]，在临床细胞治疗方面表现出良好的应用前景。
01.胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种
胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种1. 设备、耗材和试剂准备1.1.设备：生物安全柜、高速冷冻离心机、CO2培养箱、恒温振荡器。
1.2.耗材：5mL移液管、10mL移液管、25mL移液管、50mL离心管、75%酒精棉球、T75培养瓶、封口膜、无尘布、100mm皿、150mm皿、50mL注射器、16号针头、10mL注射器、输液器。
1.3.试剂：0.9%氯化钠注射液、75%酒精、无血清干细胞培养基、干细胞培养基添加物、双抗、2%Ⅰ型胶原酶。
1.4.器具：移液器、酒精喷壶、无菌剪刀、无菌止血钳、无菌组织镊、离心管架，常规止血钳。
2. 操作流程2.1.组织处理前2.1.1.将胎盘样本从4℃冰箱中取出，用含75%酒精的无尘布，擦拭胎盘采集袋外表面，将其放入传递窗中，开紫外消毒灭菌。
2.1.2.实验室技术人员按照《洁净实验室人员进场管理规程》进入实验操作区。
2.1.3.开启生物安全柜，用含75%酒精的无尘布擦拭台面及离心管架、器械、移液枪，待生物安全柜运行10分钟后方可进行实验操作。
2.1.4.在等待过程中，将无血清干细胞培养基从4℃冰箱中拿出来，常温下复温。
将分装为5mL的干细胞培养基添加物和分装为1mL的双抗以及1mL2%Ⅰ型胶原酶从-20℃冰箱中拿出常温复温，一支5mL的双抗放入37℃培养箱复温。
2.1.5.准备500mL的0.9%氯化钠注射液、16号针头、10mL注射器、移液管、输液器，用含75%酒精的无尘布擦拭0.9%氯化钠注射液瓶、16号针头、10mL 注射器以及复温结束的5mL双抗放入生物安全柜中，再取3支50mL离心管于生物安全柜中的离心管架上间隔摆放，离心管架摆放在右上角处。
2.1.6.将已灭菌的器械盒放入生物安全柜中，灭菌盒中包含止血钳*3、组织镊*3、弯剪*1和直剪*2。
2.1.7.使用生物安全柜中常规的止血钳拉开0.9%氯化钠注射液的拉盖，再使用酒精棉球擦拭0.9%氯化钠注射液瓶口，用10mL注射器吸取5mL双抗，加入到0.9%氯化钠注射液瓶，拔出注射器，将针头放入锐器盒中，注射器丢入垃圾桶中，打开16号针头包装，用止血钳将其夹住插入0.9%氯化钠注射液瓶中。
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胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定刘亭2016.7。
21目录前言 (2)1分离制备PMSC组织的选取 (4)2脐带，胎盘MSC的分离与纯化 (6)2.1胎盘组织的获取，存储与清洗 (6)2-2 脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法 (7)3 原代培养和继代培养 (11)3—1培养基 (11)3-2培养密度 (12)3-3培养条件 (13)3—4换液 (13)3—5 传代培养 (13)3—6细胞形态与生长速度 (14)3—7 MSC的冻存与复苏： (14)4细胞表面抗原检测 (14)5生长曲线 (15)6细胞周期 (15)7分化潜能 (15)参考文献 (15)附件1不同实验室从脐带血,脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法.. 16脐带血 (16)脐带 (17)羊膜 (19)绒毛膜 (19)蜕膜层 (20)胎盘 (21)整体灌注法 (22)附件2 背景知识 (22)附件3 PMSC实验所需试剂 (23)前言干细胞（Stem cell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞(Adult stem cell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力.但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织,早期研究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell， MSC）又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
MSC是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状。
胞质丰富，细胞核呈圆形,1-3个核仁。
在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等.MSC具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达,是基因治疗中重要的载体细胞。
此外,一些研究学者还发现,MSC具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应,并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。
所以，MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。
近年来MSC已逐步成为干细胞研究的热点（张慧娟等，2014)。
目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。
虽然分离方法简便，但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦的手术,并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少,每105-106个单个核细胞中大约只有1个；而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。
其他组织中,如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞，然而,从这些组织中获得的细胞数量较为有限。
以上因素,都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用.目前胎盘或脐带属于临床废弃物，容易获得，并且无污染,取材研究和应用基本无伦理学争议，研究表明胎盘或脐带含有丰富的MSC。
有研究表明PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养，细胞活性更好，还可诱导分化成脂肪，成骨等多种细胞.并且这些胎盘源的间充质干细胞（placenta—derived mesenchymal stem cells，PMSCs）具有极低的免疫原性,大多数患者对于胎盘或脐带间充质干细胞具有天然的免疫耐受,因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人—动物模型间的异种间移植，由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小，这对于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。
目前MSC主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应.动物模型研究结果表明PMSC对子宫内膜损伤（刘芳，2013），大鼠肝组织损伤(宫黎明等，2011)，APP+转基因鼠阿尔茨海默病（郭亚男等，2009）均有疗效,也可以用于构建组织工程皮肤（徐彪等，2013）。
所以,综合充分利用胎盘和脐带作为间充质干细胞新来源,优化分离纯化以及传代培养条件，加快细胞繁殖速度，降低培养成本以高效率获取大量的PMSC对于的各种疾病实验研究及医院各个科室的临床应用,都具有重要意义。
1分离制备PMSC组织的选取胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层,人足月娩出的胎盘由羊膜层、绒毛膜层和蜕膜层组成。
从脐带血（于海微等，2009；管英华等，2011），脐带(徐燕等,2009；韩之波等，2012;管英华等，2011；李艳琪等，2014；赵琳等，2016），整个胎盘（陆琰等，2009；沙文琼等，2010；刘洋等，2015;赖平等，2016）,胎盘的羊膜层（宫黎明等，2011；徐彪等，2013；张慧娟等，2014；丛姗等，2015），绒毛膜层(洪艳等，2014；韩之波等，2012)和蜕膜层（韩之波等，2013）分离培养MSC均有报道.目前大多数研究者取胎盘小叶（包括绒毛层和绒毛滋养层)进行分离（洪艳等，2014）。
胎盘的细胞成分较复杂，既有滋养细胞，也有间质细胞、血管内皮细胞和Hofbauer 细胞(沙文琼等,2010）.由胎盘组织分离制备MSC时不可避免会有其它细胞的干扰（苗宗宁等，2009），其中以数量最多的血细胞干扰为主。
分离MSC选取组织时需要考虑哪个部位的组织可能含有最多的MSC，并且尽可能降低其它种类细胞的干扰，以获得纯度高，活力强的MSC.对于人脐带血来源的MSC(human umbilical cord blood MSC， hUCB-MSC）的存在及能否稳定传代扩增，曾有一定争议，后来的实验结果证实脐带血中存在MSC，并表明脐带血来源MSC 与骨髓来源MSC具有相同的生物学特性及功能特征（于海微等，2009）。
但是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞，分离间充质干细胞的过程以丢失造血干细胞为代价，而且个体差异大(徐燕等,2009）.脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’s Jelly，外层由羊膜来源的上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路(管英华等，2011）。
不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC（human umbilical cord MSC, hUC—MSC）。
已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源（徐燕等，2009），故制备hUC—MSC一般剥离脐带动静脉和外层上皮。
管英华等（2011)比较了脐血和脐带两种来源的MSC原代培养过程，结果表明脐血中细胞成分复杂,原代培养多见成纤维样和大圆形破骨样两种形态的贴壁细胞,随着换液和传代破骨样细胞逐渐减少和消失，剩下形态较为单一的呈漩涡样的细胞集落；脐带来源培养的贴壁细胞不会随换液丢失,且细胞形态以成纤维样细胞为主，种类单一.hUC—MSCs比hUCB—MSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高.羊膜是胎膜最内层，胎盘包裹胎儿面的一层薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊壁发育而成,在胎盘面与绒毛膜相贴,由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织。
人羊膜间充质细胞来源于原条期的胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层.越来越多的研究已证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征。
其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞（human amnion-derived mesenchymal cells， hAD-MSCs）不但表达成体干细胞特性中的间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性，相关研究表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2和NANOG（张惠娟等，2014）以及SSEA—3、SSEA-4、Oct—4等胚性标志(宫黎明等，2011），近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下,可分化成来自3个胚层的所有细胞（宫黎明等，2011)。
有研究比较人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力，发现培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞(徐彪等,2013).洪艳等（2014)分别从绒毛膜和绒毛滋养层分离并培养MSC，发现在分离过程中,从绒毛膜和绒毛滋养层得到的细胞量都很多,绒毛滋养层的细胞量甚至会超越绒毛膜的细胞量。
但是在接种后培养时,由于绒毛滋养层血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的贴壁，无法贴壁就无法继续生长，由此导致后期细胞生长慢,收获细胞少。
韩之波等(2013）的研究表明来自母体的底蜕膜组织也可以分离制备MSC。
苗宗宁等(2009）将胎盘组织分为3 组，分别是中央带组即脐带附着处，边缘带组即距脐带附着点最远处和中间带组即两者之间中点处。
分别全层连续切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29 分别做免疫荧光和免疫组织化学染色，显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域，结果表明中间层的阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层和底板层；同为中间层,中央带较中间带及边缘带表达更强。
由此推测，在接近血管丰富的脐带附着部的胎盘中间层取材易于获得较丰富的PMSCs。
2脐带，胎盘MSC的分离与纯化2.1胎盘组织的获取,存储与清洗母血检测 HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。
产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病.临床足月正常剖宫产后胎盘，大小及质量在正常范围内，胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。
经与产妇及其家属签署知情同意书，实验方案经并经医院伦理委员会批准。
在产房无菌条件下获取脐带，胎盘。
文献报道中取组织后有如下处理方法：立即浸入胎盘储存袋(加拿大LABPLAS公司的无菌采样袋，含99%低糖DMEM，1％双抗即青链霉素的组织保护液）,在48 h内转移至实验室。
脐带静置于４℃冰箱12h，观察保存脐带的PBS液，若无浑浊说明无感染。
脐带采集后在6 h内进行处理，切除双侧带夹痕及淤血的部分。
无菌采集健康足月剖宫产羊膜，冰盒中2 h内运达实验室进入试验流程.无菌采集健康足月剖宫产胎盘，并立即进入分离提取程序。
文献报道中组织块的用量及获得:胎盘组织约 50 g3～5个胎盘小叶剪取胎儿侧的绒毛膜层组织10 mL眼科手术剪将组织剪碎（细碎小块；1mm3大小；呈肉糜状，以能用吸管吸取为标准；约3mm；5 mm3大小的碎块）组织绞碎分离机（近似肉糜)文献中的组织浸泡液/清洗液：＃生理盐水# D—Hank's平衡液# 磷酸缓冲液(PBS)# 杜氏磷酸缓冲液(D-PBS）# 含肝素的PBS# 含有双抗生素的PBS （0.1％的青链霉素,1％的青链霉素, 100 U/mL青霉素， 100 µg/mL 链霉素)＃含有青霉素和链霉素的无血清 DMEM /F12 培养基2-2 脐带,胎盘MSC的分离及纯化方法已报道脐带，胎盘MSC的分离方法有组织块贴壁法，酶消化法以及整体灌注法。