小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
发育生物学实验指南简要
实验一小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法。
2．了解小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法。
3．了解小鼠骨髓间充质干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：SD大鼠。
2．主要试剂：胎牛血清（FBS），DMEM--LG培养基，PBS，抗体（NSE和GFAP）。
3．主要器材与仪器：手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，培养瓶，培养皿，称量瓶，刻度离心管，吹打管，注射器，倒置相差显微镜，CO2培养箱三、实验步骤1．小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSC)的分离培养:⑴小鼠BMSC的分离和原代培养：①以颈髓离断法处死小鼠。
在无菌条件下取出小鼠股骨，除去骨表面附着的组织，用PBS 清洗干净。
②用剪刀去除股骨两端，暴露骨髓腔。
无菌条件下用5ml注射器抽取PBS约3-4ml将小鼠股骨内的骨髓冲出，收集骨髓冲洗液，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。
③收集细胞悬液约7ml并将其转入15毫升离心管中，1500r/min离心5min，弃上清液及脂肪层。
④在细胞沉淀中加入5-6ml含10%胎牛血清的DMEM一LG培养基，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。
2. 带学生在电脑上观看以往的小鼠间充质干细胞免疫荧光图片。
实验二大鼠神经干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握大鼠胚胎神经干细胞的分离培养方法。
2．了解大鼠胚胎神经干细胞的鉴定方法。
3．了解大鼠胚胎神经干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：孕龄约15天的Wistar或SD孕鼠2．试剂：条件培养基(DMEM/F12+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+20μl/mlB27)，D-Hank’s液(NaCl 8g, KCL0.4g，Na2HPO4.12H2O 0.1g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, 加水1000ml溶解，调PH 值为7.2－7.4，高压灭菌后，4℃储存备用)，0.25％胰蛋白酶（D-Hank’s液配制，过滤灭菌，-20℃储存），抗体(巢蛋白、NSE、GFAP)。
贴壁法培养不同龄小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特点
中国实验诊断学
２Ｏ 年 １ 第 ｌ 卷 Ｏ７ 月 １
第１ 期
一
ｌ 一 ３
文章编号 ：０７ ２７ ２０ ）１ ０ ３ ３ １０ —４８ （０７０ —０ １ —０
贴 壁法培养不 同龄小 鼠 骨髓 间充质干细胞 的生物学特点
杨 光 范东艳 陈 强 ， ， ， 任淑萍 ， 尹维田‘
选取出生 １ 、 周 、 周 的健 康昆明小 鼠 ， 周 ８ １ ６ 分成新 生 、 年 、 年三组 ， 青 成 采用
各组 细胞 约在 ９—１ ２天
贴 壁法分离培养骨髓间充质干 细胞 ， 进行 细胞形态 学和贴壁率 观察 ， 制生长 曲线 。结果 绘
８％一 ０ ０ ９％长满培养瓶底， 融合成单层， 传代后的骨髓间充质干细胞形态 医院 手外科 ， ｔ 吉林 长春 １０３ ； ． ３０３ ２吉林大学公共 卫生学 院 毒理学教研室 ） 摘要 ： 目的 观察不 同龄小 鼠骨髓 间充质干细胞在体 外分离 、 培养、 扩增 的过 程 ， 并对其 生物学特性进行 初步 比
较分析 ， 为下一步实验提供依据。方法
细胞 。贴壁率的观察和生长曲线显 示 ， 在相同的培养条件下 ， 新生小 鼠细胞增殖最快 ， 细胞可扩增 能力最强 ， 而成年 小 鼠细胞增殖最慢 ， 细胞可扩增能力最弱 ， 青年 小 鼠细 胞介于两 者之 间。结论 关键词 ： 骨髓 ； 间充质干细胞 ； 鼠； 小 细胞培养 中图分类号 ： ４ １ Ｑ ２ ＹＮ ｕｎ Ｆ ＮＤ ｎ－ａ Ｃ Ｅ Ａ ＧＣａｇ。Ａ ｏｇｙｎ， Ｈ Ｎ ，
ｄ 】 ｅｅ【 ｍ ｂｃ ｇｏｎ ｒｆｒ ａｋ ｒｕ ｄｆ ｕ・ ｏ
Ｂｏ￣ ｅｌ ｈ ｒｅｅ ｔｓ ｆＩ ＩＯ ＂ 瑚 ， ｌ ｔ ｃｌ ｍｉ ｆ ｍ＇ｅｔ ｇｓ ｕｔｒｄｉ ｉｏｗ ｔ ｄｅｅｔ ｌｌ ａ ａａｔ ｌ ＩＢ ￣ ｍ 邛日 ｓ ｍ ｌｏ ｃ ｏ ｄ ｅ ｎ ｅ ｌ ｅ ｎｖｒ ｉ ａ ｈｒｎ ｍｄｌ ｅ ｄｓｅ ｏ Ｉ＇ Ｔ ｅ ｅｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｃ ｕ ｔ ｈ １ ． ｄ： ｂｅ ｔｅ ｏｏ ｅｖ ｅｆ ｔ ｅｏ ｔ ｃｏ ，ｅａａｏ ，ｕｕｅａｄ 峨哪； ｏ ｉ ｒ ｗ ｍ ｓｎｈｍ ｌ ｔ ｅｓ Ｏ Ｊｄ ｖ Ｔ ｌ ｒ ｔ ａ ｒ ｆｅ ｒ ｔ ｎ ｓ ｒｔｎ ｃｌ ｒ ｎ ￣ ｅｈ ｅｕ ｘａ ｉ ｐ ｉ ｔ ｅ ｆ／ ｌ ｅ ｅｙ ａ ｓ ｍ ｃｌ ｌ ＇ ａｏ ｅ ｅ ｌ
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
２ ０ １ ３年 ４月
第１ ７卷
第４
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６ ４７ ・ － — — —
文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ —０ ６ ４ ７ —０ ４ ．
小 鼠骨 髓 间充 质 干 细胞 的体 外 分 离 培 养 和 鉴 定方 法 学 探讨
无 菌条 件 下 分 离 处 死 后 取 小 鼠双 下 肢 骨 ， 低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 液 冲 出骨 髓 ， 离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ｓ ， 用５ ｍｌ 含 １ Ｏ
胎 牛 血 清 的低 糖 ＤＭＥ Ｍ 培养液重悬 细胞。加入等体积密度为 １ ． ０ ７ ３ ｇ ／ Ｉ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ １ 分离液离心 ３ ０ ｍｉ ｎ ｓ 。取 中层 云雾 状 细 胞 。３ ７ ℃、 ５ Ｃ Ｏ 培 养箱 中 贴 壁 培 养 。取 ５ ～ １ Ｏ代 细 胞 培 养 至 对 数 生 长期 后 ， 洗 涤 离 心 。取 １ ０ ０ ｌ 细 胞 悬 液 分 别 加
Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ — ｙ ｕ ｅ 。 Ｃ ＨＥＮ Ｓ ｕ — ｐ ｉ ｎ ｇ ， ＤＩ ＮＧ Ｊ ｕ ｎ — ｌ ｉ ， ｅ ｔ ａ １ ． （ １ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ， ２ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｐ
ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ， ｆ ｉ ｎ ｄ ａ ｂｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｔ ｏ ｓ ａ ｔ ｉ ｓ ｆ ｙ ｔ ｈｅ ｉ ｒ ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎｄ ｑｕ ａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄｓ Ｔ ｈｅ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｋｉ ｌ ｌ ｅ ｄ ｕ ｎ—
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔2-2.5million的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点
干细胞培养基的选择研究背景：小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。
小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。
广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。
他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。
但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。
按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。
问题应该出现在培养基配方上。
陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。
为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。
陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。
经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。
解决方案：百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。
建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。
陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。
选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014）实施步骤：1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材；2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液；3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好；4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。
结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。
目前已经传至20代。
对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。
要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。
案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。
其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。
最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。
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第 ２ 卷第 ２ ５ 期
２０ ０ ２年 ４月
遵
义
医
学
院
学
报
ＶＯ ． ５ Ｎｏ． １２ ２ Ａｐ ． ０ ２ ｒ２ ０
ＡＣＴＡ ＡＣＡＤＥ Ｉ Ｍ ＡＥ Ｍ匣Ｄ Ｉ ＮＡＥ ＵＮＹ Ｉ ＣＩ Ｚ
小 鼠 骨 髓 间 充 质 肖雁 冰 田 虹 ，
５ ３０ ； ． ６ ０ ３ ２ 复旦大学 医学院 生理 学教研室 ， 上海 ２０ ３ ） ０ ０ １
（． １ 遵义 医学院 生 理学教研室 ， 州 遵义 贵
［ 摘
要 ］ 目的
建立成 年小 鼠骨髓间充质 干细胞 （ Ｃ 的分离 和培养 方 法 。方 法 Ｍｓ ）
应 用体 外细 胞 培养 技术 将
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
ｘ ｅ， ｕ ＷＡＮＧ Ｇｕ ｎ — ｉ ＺＨＡＮＧ ｉｙ ｅ １ （ ｅＦｉｓ ｓ ｉａ ｆ Ｊ ｌｎ Ｕｎｖ ｒｉｙ， ａ ｇ ｈ ｎ ｌ ０ ２ Ｃ ｉａ） ａ ｇｙ ， Ｈａ ｕ，ｔ ． Ｔｈ ｒｔＨｏ ｐ ｔ ｌｏ ｉｉ ｉ ｅｓｔ Ｃｈ ｎ ｃ ｕ ０ １， ｈ ｎ ａ ３
分 离 纯 化 骨 髓 ＭＳ ｓ在 含 １ Ｆ Ｓ的 Ｄ Ｃ， ５ Ｂ ＭＥ Ｌ 培 养 基 中 培 养 ＭＳ ｓ可 获 得 稳 定 生 长 的 昆 明小 鼠 ＭＳ ｓ Ｍ— Ｇ Ｃ， Ｃ 。培 养 的
ＭＳ ｓ 胞 系性 状 稳 定 ， 型 稳 定 均 一 ， 于 做 进 一 步 研 究 。 Ｃ 细 表 适 关 键 词 ： 髓 间充 质 干 细胞 ； 胞 培 养 ； 定 ； 鼠 骨 细 鉴 小
大 小 均 匀 ， 态 较 一 致 ， 为 梭 形 。Ｐ 、 ２ Ｐ 代 ＭＳ ｓ生 长曲 线 均 呈 ｓ型 。 Ｐ 形 多 １Ｐ 、 ３ Ｃ ３代 ＭＳ ｓ ５ ２ 的 细 胞 处 于 Ｇ — Ｃ ． ７ ７ Ｏ Ｇ１ 期 。Ｐ 代 ＭＳ ｓ Ｄ ４表 达 阳 性 ， 达率 为 ８ ． １ ， Ｄ３ ３ Ｃ ４ Ｃ 表 ８ ７ Ｃ ４表 达 阴 性 。结 论 利 用 密 度 梯 度 离 心 法 联 合 贴 壁 培 养 法
ｏ ｎ ｌｍ ｍａ ｏ ｙ ｌ ｓｏ ｓ ｐ ｅ ｃ ｓ ｌ ｓｏ ｅ ｅ ｉｙ ａ ｄ ｄ ｓ ａ ｅ ｄ ｆ ｉ ｆａ ｔ ｒ ｅ ｉ ｎ ｒ ｄｉｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ｖ ｒｔ ｎ ｉｅ ｓ ｅ
［２于国平 ， １］ 朱
克 ， 显 胤 ， ． 验性 自身 免 疫 性 脑 脊 髓 炎 的 小 胶 梁 等 实
取 小 鼠胫 骨 和股 骨 ， 出骨 髓 细 胞 ， ｌ ０ ３ｇ ｍｌ Ｐ ｒｏ１ 离 液 梯 度 离 心 ， 养 皿 培 取 用 ＿ ７ ／ 的 ｅｃ ｌ 分 培
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代
小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。
今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。
看来做小鼠MSC的战友越来越多。
一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。
其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。
欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。
提纲一，简版主要步骤及操作要点。
二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。
我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。
……呵呵，跑题了。
小鼠密质骨间充质干细胞的分离、培养及鉴定
Ｙｕ ａ ｎ Ｙａ ｈ ｏ ｎ ｇ ，Ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃｈ ｕ ｎ ｆ ａ ｎ ｇ ，Ｌｕ Ｚ ｈ ｉ ｙ ｏ ｎ ｇ ，Ｗ ａ ｎ ｇ Ｘｉ ａ ｏ ｌ ｉ ，Ｙａ ｎ ｇ Ｚ ｈ ｕ ｏ ｓ ｈ ｕ ｎ ，Ｌｉ Ｄｏ ｎ ｇ ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ △
Ｃ ＨＩ ＮＥＳ Ｅ Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＮＡＴＯ ＭＹ Ｖｏ １ ． ３ ６ Ｎｏ ． ６ ２ ０ １ ３
解剖学杂志
２ ０细胞 的分 离 、 培 养及 鉴 定
袁雅 红 周春 芳 卢智 勇 王 小莉 杨 卓顺 李 东升 △
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｏ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ：Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｎ ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｆ ｏ ｒ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＭＳ Ｃ ）ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ
骨 中成 功分 离培养得到 ＭＳ Ｃ， 且 高效 易行 。
关键词 密质骨 ；间充质 干细胞 ； 小 鼠；细胞培养
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ，ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｃ ｔ ｂ ｏ ｎ ｅ
（ 湖北 医药学 院 ， １附属太和医院胚胎干细胞研究 湖北省重点实验室 ，２附属 十堰 市人 民医院消化 内科 ，十堰 ４ ４ ２ ０ ０ ０ ）
摘 要 目的 ： 建立一种易操作 的 、 高效 的小 鼠间充 质干 细胞 （ ｍＭＳ Ｃ） 的分离 培养方 法 ， 并 对其 表面标 志和多 向分化潜 能进 行鉴定 ， 为 ｍＭＳ Ｃ的获取提供了新的实验依据 。方法 ： 选取 ２ ～３周 龄 Ｃ ５ ７ Ｂ Ｌ ／ ６小 鼠， 取 出双侧股 骨 、 胫骨， 冲 出其 内骨髓
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。
2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清：用于细胞培养。
4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。
5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。
离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。
2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。
4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。
2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每两天换液1次，并观察细胞形态。
待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速。
采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
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间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。