小鼠骨髓间充质干细胞培养

合集下载

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原的表达

m o u s e s
B MS Cs
rm e
A n t h ro p o to m y S c h o o l o f B a s ic
p e rf o
d
a
t th e G
u a n
gdo
n
g P ha
rm a c e u
t ic
a
l
Co
u rs e s
，
G
u a n
gdo
n
g
P ha
rm a c e u
t ic a 『
U n iv
e rs
it y f r O m O
：A r
．
c to
be
r
2 0 0 7 to Ma y 2 0 0 8
U n iv G
e rs
it y
．
M A T E R IA L S
t o t a l o f 3 I C R m i c e a n d 1 IC R n e o n a t a l m o u s e a g e d 1 d a y w e r e s u p p l i e d b y G u a n g d o n g M e d i c a l E x p e r i m e n t a l
h
Ma
h 5
,
N o 70
体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞 I
张
黎
，
、
I II 型前胶原的表达术☆
刘
靖
，
周
畅
Ex p
f o l lo
Zha
Ab
ke y
n
re s s w
io
n
o

小鼠骨髓基质干细胞的培养

小鼠骨髓基质干细胞的培养学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。

目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。

练习血细胞计数器的使用方法1 材料与方法1．1 材料，小白鼠(实验动物部提供) , 培养瓶，α-MEM 培养基5ml, 20ml空离心管，hanks 液近50ml，胎牛血清（一小离心管）0.2ml ,，双抗（青霉素+庆大霉素）0.2ml，碳酸氢钠0.2ml,10ml注射器，无菌器械包括:镊子两把(无齿镊，有齿镊，组织剪大小两把)，吸管三只（有刻度两只）酒精棉若干，酒精灯1．2 基质干细胞的培养1.2.1操作者洗手戴鞋套在通风柜中保证无菌操作，点燃酒精灯，把三只试管纸套取下，从高压灭菌的套筒中取三只吸管于试管中，并妥善放在试管架上1..2.2取0.1ml单抗于hanks液中，剩余单抗倒入α-MEM培养基中，并吸取碳酸氢钠液一滴于hanks液中，使溶液呈碱性（红色）。

1.2.3取1 月龄小白鼠1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟1.2.4弃掉上述离心好的细胞液上清，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan 染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*1042.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，3.注意事项：3.1无菌操作下进行，如组织材料遗落在非无菌区则弃之，3.2不要让液体漫过计数池，并且让标本在格子架上流动，计数池液体要充分，不要让碎片或者气泡进入到细胞计数池中，在格子上的细胞不用记数在内，要数在小格中的细胞，3.3小鼠处死后要迅速制作股骨标本，皮下剪开时切勿伤及腹腔，及大血管，影响标本制作3.4吹打时不要产生气泡，。

小鼠骨髓基质干细胞的培养

1.2.4弃掉上述离心好的细胞液上清，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟
1.2.5弃掉上述离心好的细胞液上清，加入5ml的α-MEM 培养基，加胎牛血清，，再加入12mlhank液，并用吸管反复吹打后再次离心1000转，5分钟
1.2.6弃上清，加样抢取0.1ml于小离心管中，再加入0.7ml（相当于7倍稀释）的Trypan染料，在相差显微镜下将盖玻片盖好在计数池上开始计数，剩余细胞悬液加入培养瓶中在适宜环境下进行接种培养
小鼠骨髓基质干细胞的培养
学号122010000178，2010级硕士同仁医院，严森
骨髓基质干细胞( marrow st romal stem cell,MSC)是一种来源于骨髓的成体干细胞, 本实验通过小鼠骨髓基质干细胞的培养及对其进行体外细胞特性的研究。
目的: 取小鼠股骨骨髓进行骨髓基质干细胞的原代培养,通过相差显微镜、光镜及扫描电镜观察, 了解骨髓基质干细胞的生长情况及其特点。练习血细胞计数器的使用方法 1 材料与方法
1.2.3取 1 月龄小白鼠 1只,雌雄不限,体重约20g, 断颈脱臼处死, 无菌条件下暴露股骨, 在培养皿中去除皮肤，附带的肌肉和骨膜,切断股骨,切断上肢，并将每一肢上下剪下两个小口便于冲洗，剥离四肢时用hanks 液进行冲洗,
1.2.3分次取12mlhanks液于10ml注射器中，分别灌洗四肢骨髓，一肢骨髓用去3ml，反复上下冲洗，用空的大离心管(20ml)收集冲洗液，并将冲洗液收集好后加盖离心，1000转，5分钟
可见细胞数目：四大个细胞总数/4*稀释倍数*104
2.结果：四个大格是50个细胞的，计算的结果：8.75×105/ml个，
3.注意事项：

小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨

中国实验诊断学
２０１３年４月
第１７卷
第４
－
－
－
—
—
６４７・－ — — —
文章编号：１００７ —４２８７（２０１３）０４ —０６４７ —０４．
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
无菌条件下分离处死后取小鼠双下肢骨，低糖ＤＭＥＭ培养液冲出骨髓，离心５ａｉｒｎｓ，用５ｍｌ含１Ｏ
胎牛血清的低糖ＤＭＥＭ培养液重悬细胞。加入等体积密度为１．０７３ｇ／Ｉｐｅｒｃｏｌ１分离液离心３０ｍｉｎｓ。取中层云雾状细胞。３７ ℃、５ＣＯ培养箱中贴壁培养。取５～１Ｏ代细胞培养至对数生长期后，洗涤离心。取１００ｌ细胞悬液分别加
Ｇｕａｎｇ — ｙｕｅ。ＣＨＥＮＳｕ — ｐｉｎｇ，ＤＩＮＧＪｕｎ — ｌｉ，ｅｔａ１．（１．ＤｅｐａｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，２．ＤｅｐａｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｌｏｇｙＰ
ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ，ｆｉｎｄａｂｅｔｔｅｒｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｔｏｓａｔｉｓｆｙｔｈｅｉｒｑｕａｌｉｔｙａｎｄｑｕａｎｔｉｔｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｋｉｌｌｅｄｕｎ—

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。

小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代

小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代之flamerking图文版[精华]很多战友发email或PM向我询问小鼠MSC的培养方法，我零零散散地一个个回复过几次，由于我平时时间不是很多，所以回答地时候有些内容写的不是很详细。

今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。

看来做小鼠MSC的战友越来越多。

一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。

其实我小鼠MSC在我的课题中不是主角，只是起一个control的作用，因此我在这方面的经验可能没有一些专门做小鼠MSC的战友丰富，不过我还是很愿意把我的经验写出来供大家参考，希望能够起到“抛砖引玉”的作用。

欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。

提纲一，简版主要步骤及操作要点。

二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。

我先顶一下,由于我还是新手,故不能说是经验介绍,只好讲让你们指出缺点,谢谢斑竹1. 试剂及材料准备MEM,10%FCS,手术器械,培养瓶,200目滤网,5ml注射器2. 动物手术及取材CR小鼠1只,酒精浸泡5分钟,取股,胫,肱骨,用基培冲出骨髓,滤过,1000转离心,完培重悬,接种于25厘米培养瓶3. 原代细胞培养:,3天后首次换液,自己发现一周贴壁细胞就铺满达90%,自行传代4. 细胞传代:消化下来很少,能下来的增长很慢5. 讨论:没经验欢迎斑竹的继续讲解,希望有经验的老师们能不啬指教羽之无限版主,能有空再讲讲吗这几天,我的原代就是不长,42天了,25平方厘米的培养瓶还未铺慢,不能传代真是天天盼着你啊呵呵，不好意思，最近我的sony笔记本又坏了，上次坏了几次维修部修不好，给我换了台新的，结果以用了没2个月又不能启动了，真是麻烦，我的资料都在里面，最近实验又忙，没空去维修部……不过明天我就去了。

……呵呵，跑题了。

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法

原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛应用于组织工程、再生医学等领域。

原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。

本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。

一、实验材料1.骨髓样本：取自健康志愿者或实验动物（如大鼠、小鼠等）。

2.PBS缓冲液：磷酸盐缓冲液，用于细胞洗涤和分离。

3.胎牛血清：用于细胞培养。

4.抗生素：如青霉素和链霉素，用于细胞培养液中，防止细菌感染。

5.细胞分离液：如Ficoll分离液、Percoll分离液等。

6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。

二、分离方法1.骨髓样本采集：在无菌条件下，从志愿者或实验动物体内抽取骨髓，置于含有抗凝剂的离心管中。

2.骨髓细胞分离：将骨髓样本用PBS缓冲液稀释，然后缓慢加入细胞分离液，进行密度梯度离心。

离心后，收集界面层的细胞，即含有骨髓间充质干细胞的一层。

3.细胞洗涤：用PBS缓冲液洗涤细胞，去除残留的分离液和红细胞。

4.细胞计数：用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数，调整细胞浓度为合适的值。

5.细胞接种：将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。

三、提取方法1.原代培养：将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养，待细胞生长至80%-90%汇合时，进行传代。

2.传代培养：将原代细胞用胰蛋白酶消化，然后按照1:2或1:3的比例进行传代。

传代后的细胞继续培养至所需细胞量。

3.细胞冻存：将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存，以备后续实验使用。

4.细胞复苏：将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化，然后用细胞培养液重悬，继续培养。

四、注意事项1.在实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止细胞污染。

2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行，以保持细胞活性。

3.选择合适的细胞分离液和离心条件，以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。

小鼠骨髓间充质干细胞使用说明

小鼠骨髓间充质干细胞小鼠骨髓间充质干细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠骨髓间充质干细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠骨髓间充质干细胞产品简介：产品名称：小鼠骨髓间充质干细胞组织来源：正常小鼠骨髓产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠骨髓间充质干细胞简介：小鼠骨髓基质系统内存在的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stemcells，BM-MSCs）是一种除造血干细胞以外的、具有多向分化潜能的干细胞，可以向骨、软骨、肌组织、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，因此可以作为组织工程中的种子细胞。

本公司生产的小鼠骨髓间充质干细胞采用冲洗骨髓，密度梯度离心，骨髓基质细胞专一性选择培养筛选获得，经检验细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

小鼠骨髓间充质干细胞接种小鼠肝癌组织诱发肝癌细胞坏死

北京大学学报（医学版）ＪＵＮＬＯＥＩＧＵＩＥＳＴＨＡＴＣＥＥ）Ｖ１０Ｎ．Ｏｔ２０ＯＲＡＦＰＫＮＮＶＲＩＹ（ＥＬＨＳＩＮＣＳｏ．ｏ５ｃ．０８４
・５・４３
ｗｅｈｒＭＳｓｃｎｄｆｒｎｉｔｏｈｐｔｃｔｓｉＣｍｉｒｅｖｒｎｎｎａｍｏｓｄｌｆｏｔｏｏｉｈｔｅＣａｉｅｅｔｅｔｅａｏｙｅｎＨＣｃｏｎｉｍｅｔｉｕｅｍｏｅｒｔｐｃｆａｏｏｈ
存期，用免疫荧光法和激光共聚焦技术检测小鼠肝组织白蛋白表达，行常规组织学检查。结果：Ｓｓ植组利并ＭＣ移平均生存期为２（５５ｄ９％可信区间：２～８ｄ，照组平均生存期为２（５可信区间：０～３ｄ，组间生存期２２）对１ｄ９％２２）但差异无统计学意义（００１３。激光共聚焦显微镜观察到在肿瘤边缘和瘤体内可见ＣＳＰ＝．７）ＦＥ标记细胞有白蛋白表达；与对照组相比，Ｃ移植组肝癌组织内出现大片坏死。结论：鼠骨髓ＭＳｓ在原位肝癌移植小鼠模型的另ＭＳｓ小Ｃ可
・
论著

・
小鼠骨髓问充质干细胞接种小鼠肝癌组织诱发肝癌细胞坏死
姜晗防，任军
１０４）０１２（北京大学临床肿瘤学院，北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所内科，北京［摘

骨髓来源间充质干细胞培养上清液减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

骨髓来源间充质干细胞培养上清液减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤许欣婷;董明清;胡美;徐敦全;李志超;吴昌归【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2014(030)002【摘要】目的:观察经尾静脉输注骨髓间充质干细胞培养上清液(MSCs CdM)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤的治疗作用及其机制.方法:采用全骨髓培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代时观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志,并且收集上清液用超滤离心管进行离心.30只BALB/c小鼠随机分为对照组、LPS 模型组和MSCs CdM治疗组.对照组腹腔内注射生理盐水(0.01 mL/g),LPS组和MSCs CdM治疗组腹腔内注射LPS(5 mg/kg,0.01 mL/g)制备急性肺损伤模型.造模1h后经尾静脉输注MSCs CdM(MSCs CdM治疗组)或生理盐水(LPS组或对照组)300 μL.6h后处死小鼠,留取标本检测肺组织病理形态学、肺组织湿干重比(W/D)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量、血清及BALF中细胞因子水平和肺组织中髓过氧化物酶(MPO)的活性.结果:与对照组比较,LPS处理后肺组织病理损伤严重,BALF中蛋白、血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量、肺组织中MPO活性及肺组织湿干重比均显著升高.与LPS组比较,MSCs CdM治疗组肺组织病理损伤程度减轻,BALF中蛋白、血清TNF-α和IL-6含量、肺组织中MPO活性及肺组织湿干重比均显著降低,而BALF中白细胞介素10 (IL-10)和角质细胞生长因子(KGF)水平显著高于LPS组和对照组.结论:骨髓间充质干细胞培养上清液可有效减轻LPS诱导的急性肺损伤,其作用机制可能与其调节肺部TNF-α、IL-6、IL-10和KGF的水平有关.【总页数】5页(P286-290)【作者】许欣婷;董明清;胡美;徐敦全;李志超;吴昌归【作者单位】第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科,陕西西安710038;第四军医大学病理和病理生理教研室,陕西西安710038;第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科,陕西西安710038;第四军医大学病理和病理生理教研室,陕西西安710038;第四军医大学病理和病理生理教研室,陕西西安710038;第四军医大学西京医院呼吸与危重症医学科,陕西西安710038【正文语种】中文【中图分类】R363.2+2【相关文献】1.移植骨髓间充质干细胞减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤 [J], 孙磊;王小明;斯琴;于晓红;林宇;邱劲;郭恒怡;吴其夏2.骨髓间充质干细胞对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的早期治疗作用 [J], 邰文琳;董昭兴;张丹丹;王殿华3.金桔精油通过抑制p38MAPK和NF-κB信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤 [J], 陈昱晓;王娜;徐李玲;赵国强;檀雨钊;蒋伟哲;付书婕4.白藜芦醇减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤 [J], 粟青;李文浩;朱爱萍;曾晓凤;陈磊;刘佳贝;孙国瑛5.基于Nrf2通路探讨阿里红三萜酸减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的作用 [J], 古丽尼歌尔·阿布都米吉提;沙依拜·沙比提;丛媛媛;帕丽达·阿不力孜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点

干细胞培养基的选择研究背景：小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。

小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。

广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。

他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。

但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。

按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。

问题应该出现在培养基配方上。

陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。

为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。

陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。

经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。

解决方案：百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。

建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。

陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。

选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014）实施步骤：1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材；2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液；3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好；4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。

结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。

目前已经传至20代。

对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。

要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。

案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。

其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。

最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

ｘｅ，ｕＷＡＮＧＧｕｎ — ｉＺＨＡＮＧｉｙｅ１（ｅＦｉｓｓｉａｆＪｌｎＵｎｖｒｉｙ，ａｇｈｎｌ０２Ｃｉａ）ａｇｙ，Ｈａｕ，ｔ．ＴｈｒｔＨｏｐｔｌｏｉｉｉｅｓｔＣｈｎｃｕ０１，ｈｎａ３
分离纯化骨髓ＭＳｓ在含１ＦＳ的ＤＣ，５ＢＭＥＬ培养基中培养ＭＳｓ可获得稳定生长的昆明小鼠ＭＳｓＭ— ＧＣ，Ｃ。培养的
ＭＳｓ胞系性状稳定，型稳定均一，于做进一步研究。Ｃ细表适关键词：髓间充质干细胞；胞培养；定；鼠骨细鉴小
大小均匀，态较一致，为梭形。Ｐ、２Ｐ代ＭＳｓ生长曲线均呈ｓ型。Ｐ形多１Ｐ、３Ｃ３代ＭＳｓ５２的细胞处于Ｇ — Ｃ．７７ＯＧ１期。Ｐ代ＭＳｓＤ４表达阳性，达率为８．１，Ｄ３３Ｃ４Ｃ表８７Ｃ４表达阴性。结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法
ｏｎｌｍｍａｏｙｌｓｏｓｐｅｃｓｌｓｏｅｅｉｙａｄｄｓａｅｄｆｉｆａｔｒｅｉｎｒｄｉｔｅｉｎｓｖｒｔｎｉｅｓｅ
［２于国平，１］朱
克，显胤，．验性自身免疫性脑脊髓炎的小胶梁等实
取小鼠胫骨和股骨，出骨髓细胞，ｌ０３ｇｍｌＰｒｏ１离液梯度离心，养皿培取用＿７／的ｅｃｌ分培

小鼠骨髓间充质细胞原代培养及传代

今天又有一个战友PM我，询问我培养方法。

看来做小鼠MSC的战友越来越多。

一遍遍地重复写很费时间（想粘贴复制又找不到上次写的在哪～惨！），所以我想还是发贴公布一下。

欢迎各位同道对我的方案进行批评和指正，与大家一起分享你们的经验和智慧。

提纲一，简版主要步骤及操作要点。

二，完整版1. 试剂及材料准备2. 动物手术及取材3. 原代细胞培养4. 细胞传代5. 讨论时间关系，今天先给个简版。

……呵呵，跑题了。

骨髓间充质干细胞条件培养液对小鼠卵母细胞的孤雌激活作用

ＭｅｉａＵｎｖｒｉ，Ｈｅｅ２００，Ｃｉａｄｃｌｉｅｓｔｙｆｉ３０１ｈｎ）
【ｂｔａｔ０ｂｅｔｅＴｖｓｇｔｔｆｃｆｏｄｉｅｄｍｏｍｓｎｈｍｌｔｍｃｌＣＡｓｃ】ｒｊｃｉｏｉｅｔａｅｈｅｅｔｏｎｉｏｄｍｅｉｆｅｅｃｙａｓｅｓ（Ｍ）ｏｅｖｎｉｅｆｓｃｔｎｕｅｌｎｔｈ
ｐｒｈｎｇｎｔｃｉａｉｎａｄｄｖｌｐｎｆｕｅＭＩｏｃｔｓａｔｅｏｅｅｉａｔｔｎｅｅｏｍｅｔｓＩｏｙｅ．ＭｅｈｄＭｏｓｓｎｈｍａｓｍｅｌＭＳｃｖｏｏｍｏｔｏｓｕｅｍｅｅｃｙｌｔｃｌｅｓ（Ｃ）ｗｅｅｒ
ｏｏｓｎＭｕｅＯｏｙｅＰａｔｎｇｎｅｉｔａｉｎｃｔｒｈｅＯｅｔｃＡｃｉｔｏｖ
ＦＥＮＧｎ — ｎ，ＺＨＯＵｎ，ＬＩＣａ —ｏ，ＧＡＯｎ，ＬＩＤｉｇｑｉｇＹｉｇｉｒｎｇＴｉｇＮＧｎ’ Ｂｉ ’
（．ｎｕｒｖｎｅＫｅａｏａｏｙｏｌｃｌｒＭｅｉｉｅ１ＡｈｉＰｏｉｃｙＬｂｒｔｒｆＭｏｅｕａｄｃｎ，ＡｎｕｒｖｎｉｌＨｏｐｔｌｆｌｔｄｔｈｉｏｉｃａｓｉｉａｅｏＰａＡｆｉ
ＡｎｕｉＭｅｉａｉｅｓｔｈｄｃｌＵｎｖｒｉｙ，Ｈｅｅ００１，Ｃｈｎｆｉ２３０ｉａ；２Ｄｅａ．ｐ￣ｍｅｆＯｂｓｅｒｃｎｎｃｌｇｎｔｏｔｔｉｓａｄＧｙｅｏｏｙ，ＡｎｉＰｒｖｎｉｌＨｏｐｉｌＡｆｉｉｔｄｔｈｕｈｕｏｉｃａｓｔｆｌａｅｏＡｎｉａ

BMSCs成脂成骨分化实验总结

骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养以及成脂、成骨诱导分化一，C57小鼠BMSCs原代培养1，实验前准备好相关手术器械，培养器材及相关试剂PBS 平衡缓冲液、10％FBS，IMDM培养基。

2，脱颈法处死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，转移至超净工作台中，无菌条件下分离出小鼠的长骨(股骨和胫骨)，浸泡于PBS溶液中。

3，对股骨和胫骨进行深层次解剖，去除附着的肌肉组织，剪掉长骨两端的干骺端，用10％FBS，IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白，收集洗涤液，用移液枪轻轻吹散分离为单个细胞。

4，细胞接种于六孔板中培养，轻微摇匀，使细胞在孔中均匀分布，放置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养，培养期间不要移动六孔板，使BMSCs充分贴壁。

5，培养48h后换液，用预热的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，添加新鲜培养基，之后每隔48h换液1次。

原代培养6-7d 后细胞铺满80％(图1)，可进行传代培养。

图1：BMSCs原代培养6-7d二，BMSCs成脂诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成脂诱导培养基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰岛素，1μM 地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。

3d换液1次，分化12d。

待脂滴形成后进行油红O染色，PBS缓冲液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS缓冲液清洗2次，油红O染液浸染30min，PBS缓冲液清洗2次，苏木素染液浸染1min，弃去染液，倒置显微镜下观察拍照。

成脂诱导分化过程中发现在诱导5d时，细胞形态开始变圆并大量脱落，部分细胞中出现细小脂滴(图2)。

图2：BMSCs成脂诱导5d三，BMSCs成骨诱导分化BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰岛素，0.1μM 地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。

小鼠骨髓间充质干细胞原代培养PPT课件

细胞生长曲线的绘制与分析
生长曲线绘制
通过定时记录细胞数量或密度，绘制出细胞的生长曲线，反映细胞的生长规律和生长速率。
生长速率分析
分析生长曲线的变化趋势，计算细胞的生长速率，为优化培养条件和提高细胞产量提供依据。
生长周期
通过生长曲线的绘制和分析，了解细胞的生长周期和倍增时间，有助于控制细胞的传代和扩增。
细胞分裂增殖情况
观察细胞分裂增殖的情况，有助于了解细胞的增殖能力和生长潜力，为后续实验提供依据
。
细胞形态的观察与描述
细胞形态
在显微镜下观察细胞的形态，包括细胞大小、形状、染色深浅以及核质比例等特征。
描述方法
采用专业术语和描述方式，准确描述细胞的形态特征，为细胞鉴定和分类提供依据。
形态变化
在培养过程中，观察细胞形态的变化，有助于了解细胞的生长和分化情况。
细胞计数与接种
对分离出的细胞进行计数，并按照适当的密度接种到培养容器中。
培养容器
选择适当的细胞培养容器，如细胞培养瓶、平板等。
培养条件与维持
温度与湿度
将培养容器放置在恒温、恒湿的培养箱中，保持温度和湿度适宜。
பைடு நூலகம்
气体环境
控制培养箱内的气体环境，如CO2 浓度，以维持培养基的pH值。
换液与传代
定期更换培养基，并适时进行细胞的传代，以维持细胞的生长状态。
基础培养基
选择适合细胞生长的基础培养基，如 DMEM、RPMI等。
培养基的灭菌与储存
确保培养基经过严格灭菌，并在无菌条件下储存。
添加成分
根据细胞类型和培养需求，添加适量的生长因子、抗生素等。
细胞接种与培养
细胞分离