人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择

人羊膜间充质干细胞分离培养：胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方【摘要】背景：文献报道人羊膜间充质干细胞提取方法各不一致，得到的细胞数量各不相同。

目的：探索人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。

<br> 方法：无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，分别通过4个实验7种方法体外培养人羊膜间充质干细胞。

①实验一：分别采用3种方法：0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min；0.75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min；0.05 g/L胰蛋白酶与0.75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min。

②实验二：采用0.05 g/L的胰蛋白酶消化30 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min。

③实验三：分别采用2种方法：0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后，再加入0.75 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min；0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化40 min后，再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min。

④实验四：采用0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后，再加1 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min。

显微镜下观察其形态，研究人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。

<br> 结果与结论：用0.05 g/L的胰蛋白酶连续消化2次每次消化30 min，然后用1 g/L的胶原酶消化60 min是最合适的体外分离培养条件。

细胞成细长梭形或星形，胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。

说明实验四采用的胰酶和胶原酶消化的时间合适，而且胶原酶的浓度合适，得到的细胞数量最多。

%BACKGROUND:Extraction methods of human amniotic mesenchymal stem cells are inconsistent in the number of cells. <br> OBJECTIVE:To explore the optimal method to in vitro isolate and culture human amniotic mesenchymal stem cells. <br> METHODS:Under sterile conditions, ful-term cesarean fetal amniotic membrane was cut into pieces, then to isolate human amniotic mesenchymal stem cells by seven methods in four experiments. In experiment 1, human amniotic mesenchymal stem cells were isolated by the fol owing three methods:(1) 0.05 g/L trypsin digestion for 10 minutes fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 60 minutes;(2) 0.75 g/L col agenase I for 120 minutes;(3) co-digestion with 0.05 g/L trypsin and 0.75 g/L col agenase for 60 minutes. In experiment 2, the samples were digested with 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 30 minutes. In experiment 3, the samples were digested by two methods:(1) 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes×2, fol owed by 0.75 g/L col agenase digestion for 60 minutes;(2) 0.05 g/L trypsin digestion for 40 minutes×2, fol owed by 0.75g/L col agenase digestion for 60 minutes. In experiment 4, the samples were digested with 0.05 g/L trypsin digestion for 30 minutes×2, fol owed by 1 g/L col agenase digestion for 60 minutes. Folowing&nbsp;morphology observation under a microscope, we studied the most suitable method for isolating human amniotic mesenchymal stem cells. <br> RESULTS AND CONCLUSION:Digestion with 0.05 g/L trypsin for 30 minutes twice fol owed by 1 g/L of col agenase digestion of 60 minutes was the most suitable isolation and culture condition in vitro. cells became elongated fusiform or star-shaped with rich cytoplasm, and nuclei were round with 1-3 nuts. We can harvest the most number of human amniotic mesenchymal stem cells using the method described in experiment 4.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】6页(P944-949)【关键词】干细胞;培养;间充质干细胞;羊膜间充质干细胞;细胞培养;胰蛋白酶;胶原酶;863项目【作者】张惠娟;丛姗;梁美萍;刘俊平;黄利刚;宋瑾;曹贵方【作者单位】内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018;内蒙古农业大学动物组织胚胎与发育生物学实验室，内蒙古自治区呼和浩特市 010018【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言 Introduction干细胞是一种能够自我更新且未分化的细胞，在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。

按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两类[1]。

胚胎干细胞来源于早期的胚泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力[2-3]，但其伦理学争议严重影响并制约了临床应用研究进展。

成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，传统的观念认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。

然而，近几年来的很多研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力，为临床应用这种多潜能细胞，治疗多种疾病带来了新的希望[4]。

间充质干细胞又称为基质干细胞，是属于成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。

这种细胞具备干细胞定义的两个基本特性：①能够自我更新。

②可分化成两个或两个以上其他品系的细胞。

间充质干细胞是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状[5]。

胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁[6]。

在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。

间充质干细胞除了具有多系分化的功能之外，还具有低免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节等功能，使其除了在治疗组织缺损、器官退行性疾病取得了重要进展以外，在肿瘤及免疫疾病治疗中也具有相当广泛的应用前景。

此外，一些研究学者还发现，基质干细胞具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。

据国外的一些临床试验和动物实验都己基本证实，成体干细胞有两个引人注意的生物学特性：一是成体干细胞注入体内后，有明显的趋向性，较明显集中到受损伤的部位；二是成体干细胞到达受损的部位后，在局部的微环境诱导，发生了明显的诱导分化，使成体干细胞向着已损伤组织修复所需要的细胞，进行了导向性的分化。

所以，近年来间充质干细胞已逐步成为干细胞研究的热点。

目前虽然骨髓仍作为是间充质干细胞的主要来源，但骨髓提取间充质干细胞为一个侵入性的过程，并且干细胞的质量和数量都随着供者年龄的增长而逐渐降低[7]。

其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞，然而，从这些组织中获得的细胞数量较为有限。

所以，寻找更易获得、含量丰富并且易于培养的间充质干细胞新来源，对间充质干细胞的实验研究及临床应用，都具有重大意义。

以上因素，都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用。

羊膜是胎膜最内层，是由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，由胚胎羊膜囊壁发育而成，薄而透明，人羊膜间充质细胞来源于胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层。

越来越多的研究已证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征，羊膜在胎盘面与绒毛膜相贴，胎盘不只在胚胎的发育、营养、耐受力方面发挥作用，而且还具备一种潜在的干细胞能力。

当在母体内时，胚外中胚层来源的间充质干细胞不断的分化，成为由结缔组织形成的血管，而胚胎借此完成与母体的物质交换。

胎盘在胎儿分娩出生后就完成使命成为“废弃物”，在胎儿出生后常被丢弃。